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目的观察针刺干预对大鼠脑缺血再灌注后神经发生及神经功能恢复的影响,探讨针刺干预在缺血性脑损伤后神经发生及神经功能重建中的作用及可能机制,为针刺治疗缺血性脑血管病提供实验依据。方法1.制备动物模型:采用大脑中动脉栓塞法(middle cerebral artery occlusion, MCAO)制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。SD(Sprague-Dawley)成年雄性大鼠,10%水合氯醛腹腔麻醉,分离右侧颈总动脉(common carotid artery, CCA)、颈内动脉(internal carotid artery,ICA)和颈外动脉(extemal carotid artery, ECA)。用浓硝酸和肝素处理过的尼龙栓子沿剪口从ECA插入,经CCA进入ICA,以CCA分叉处计算,进线深度约18.0±0.5mm,越过大脑中动脉(middle cerebral artery, MCA)起始部至大脑前动脉(anterior cerebral artery, ACA)根部,阻断MCA血流,造成局灶性脑缺血状态,缺血2h后缓慢将尼龙栓子拔出,结扎ECA残端,分别于再灌注不同时间点处死大鼠取材。2.BrdU掺入方法:动物在取材前三天腹腔注射BrdU,剂量50mg/kg,每天2次,最后一次注射2h后取材。3.电针方法:参照中国针灸学会实验针灸研究会华兴邦等制定的《实验动物穴位图谱》,接电针治疗仪,取大鼠的“百会”和“水沟”两穴,于脑缺血再灌注开始后针刺,针刺频率为2～15Hz,间断疏密波,刺激强度从3mA起,每10min增加1mA,终强度为5mA,持续时间为30min。4.TTC染色:雄性SD大鼠,随机分为假手术实验对照组(sham)、单纯脑缺血组(I)、脑缺血再灌注组(I/R)。于脑缺血30min、45min、1h、24h;脑缺血45min再灌注24h、3d;脑缺血1h再灌注24h、3d取材行TTC染色。5.脑内新生细胞检测:雄性SD大鼠,随机分为sham组、I/R组、脑缺血再灌注+针刺组(I/R+EA)。大鼠于脑缺血2h再灌注3d、7d、14d取材,制备脑细胞悬液,流式细胞仪(Flow Cytometry, FCM)检测脑内新生细胞。6.Nestin蛋白检测:雄性SD大鼠,随机分为sham组、I/R组、I/R+EA组。大鼠于脑缺血2h再灌注7d后取材,应用Western blot检测大鼠海马和纹状体内Nestin蛋白的表达。7.雄性SD大鼠,随机分为sham组、I/R组、I/R+EA组。脑缺血2h再灌注7d后取材,制备冰冻切片,进行如下检测:(1)免疫/荧光免疫组织化学单色标记方法检测BrdU阳性细胞:显微镜/激光共聚焦显微镜下观察新生细胞的表达及表达部位。(2)免疫/荧光免疫组织化学双色标记方法检测BrdU+GFAP阳性细胞:显微镜/激光共聚焦显微镜下观察新生胶质细胞的表达及表达部位。(3)免疫/荧光免疫组织化学双色标记方法检测BrdU+NF200阳性细胞:显微镜/激光共聚焦显微镜下观察新生神经细胞的表达及表达部位。(4)免疫组织化学双色标记方法检测BrdU+Ach阳性细胞:显微镜下观察新生神经细胞有无功能。8.神经功能重建:雄性SD大鼠,随机分为sham组、I/R组、I/R+EA组。术前7d对大鼠进行水迷宫训练,分别记录术前、脑缺血12h再灌注1w、2w、1m的逃避潜伏期(escape latency, EL)。结果1.随脑缺血时间延长大鼠脑梗塞面积增大;脑缺血45min再灌注24h、脑缺血1h再灌注24h大鼠脑梗塞面积均较单纯脑缺血45min、单纯脑缺血1h增大,脑缺血45min再灌注3d、脑缺血1h再灌注3d大鼠脑梗塞面积均较单纯脑缺血45min、单纯脑缺血1h减少。2.脑缺血再灌注3d缺血侧脑组织BrdU/FITC标记新生细胞的开始表达,7d达高峰,平均荧光强度(mean fluorescence intensity, MFI)为304.00±6.97,再灌注14d MFI开始下降(265.60±7.35);与sham组(176.95±9.33)、I/R组(304.00±6.97)比较,I/R+EA组(362.87±16.08)MFI明显增加(P<0.01)。3.与sham组比较,I/R组海马及纹状体Nestin蛋白的表达升高,I/R+EA组Nestin蛋白的表达较I/R组明显升高。4.新生细胞表达(1)各组脑内均有新生细胞,主要集中于侧脑室区;(2)缺血损伤侧侧脑室区、海马CA1区、纹状体、蛛网膜下腔及额顶叶皮层新生细胞有较多表达;(3)损伤侧纹状体的新生细胞表达:与sham组比较,I/R组新生细胞明显增多(P<0.01),;I/R+EA组新生细胞较I/R组新生细胞明显增多(P<0.01);(4)新生细胞有少量GFAP表达阳性,主要集中于侧脑室区、纹状体与大脑皮层,I/R+EA组较I/R组表达增加;(5)I/R+EA组新生细胞有少量NF200表达阳性,主要集中于缺血侧纹状体与大脑皮层部位;sham组与I/R组未发现NF200表达阳性;(6)I/R+EA组新生细胞少量Ach表达阳性,主要集中于纹状体部位。5.I/R组与sham组比较,EL明显增大(P<0.01);I/R+EA组与I/R组比较,EL明显较小(P<0.01);I/R组与I/R+EA组大鼠EL均在脑缺血再灌注后1w达到最高,脑缺血再灌注后2w开始下降,脑缺血再灌注后1m降至最低。结论1.急性局灶性脑缺血再灌注可诱导大鼠脑内新生细胞增殖。2.电针干预可诱导脑内新生细胞增殖,并促进新生细胞分化为胶质细胞与神经细胞;电针干预后少量新生神经细胞已经具有分泌Ach的活性和功能。3.电针干预可促进脑缺血再灌注后大鼠神经功能的恢复。