线粒体是细胞内重要的亚细胞器,是能量代谢主要场所,参与众多生命过程。实时精准的监测线粒体内微环境和及其微结构的变化,是细胞生物学的重要课题,而基于线粒体选择性功能荧光染料的成像技术已成为研究线粒体的最重要手段之一。然而,传统线粒体靶向染料的标记特异性和定量探测的准确性容易受到微环境波动的影响。在一些尖端成像应用中,比如,单分子定位超分辨成像,常规染料往往需要高强度激光进行激发/激活,会对细胞造成较严重的光损伤;或需要特殊辅助成像条件,也会对细胞活性造成影响。本文以罗丹明染料为母体,通过甲酰基的引入提升线粒体定位的稳定性,利用比率型探针的设计提升检测的精准度,设计合成了一系列线粒体靶向型荧光染料,并评估了系列探针在多种生理、病理条件下的应用性能及其荧光信号用于医学诊断和生物研究的可靠性。线粒体温度作为重要的微环境因子,直接指示了线粒体代谢的活性与状态,因此对其进行精准测量具有重要的生物意义。本文设计合成了基于罗丹明B的线粒体温敏探针Mito-TEM,该分子利用开环罗丹明B的阳离子特性实现线粒体标记,并引入对甲酰基苯基为锚定基团与蛋白中的氨基反应实现稳定的共价键标记,克服了现有温度探针在线粒体膜电位降低时容易脱靶的缺陷,提高了荧光传感的可靠性。Mito-TEM在线粒体中温度敏感性可达到6.65%/℃;在光辐射和药物刺激过程中,实现对细胞线粒体温度的检测。基于荧光强度的检测易于受到染料浓度在细胞内分布、激发光强度等因素的影响,其检测准确性仍有改善的空间。因此,本文继续开发了基于罗丹明B和BODIPY的比率型温度探针Mito-TEM2.0,提升线粒体温度探测的精准度。该探针分子通过罗丹明B-BODIPY染料对双荧光信号的比率定量指示线粒体内温度,同时利用共价键对线粒体进行稳定标记,从而达到长时间定量监测正常或病理状态下线粒体的温度变化。利用荧光比率成像技术,Mito-TEM 2.0实时定量指示了细胞和斑马鱼在致病菌或致病物质引发两种炎症模型中温度升高可达～7℃,并可视化揭示了两种炎症状态下线粒体温度变化轨迹的差异性。线粒体形态改变与代谢功能障碍和众多疾病密切相关,精准观测线粒体形态的细微变化对评价线粒体的功能具有重要意义。本文设计合成了线粒体质子环境敏感型染料RhB-TPP-A用于线粒体超分辨成像。受线粒体内质子梯度调控,该染料分子结构产生“开环—闭环”的可逆变化,进而引起荧光的“开—关”的快速切换,以实现染料分子“自发闪烁”的目的,在较低的激光功率下即可实现活细胞超分辨成像。RhB-TPP-A在低光强下具有高开关频率（14.7per 100frames）、高定位精度（22nm）的单分子发光性能,通过超分辨成像揭示了光辐射或药物刺激引发的线粒体网络碎片化现象。为了拓展罗丹明染料在精准成像领域的应用,本文继续通过模块化设计,开发系列靶向不同亚细胞器的“自发闪烁”型长波长罗丹明染料。通过优化硅基罗丹明的合成工艺,构建了具有通用衍生位点的平台染料HMSiR-Alk,并利用“Click”反应连接各种靶向性基团,高效、模块化合成了 Lyso-HMSiR、Mito-HMSiR、ER-HMSiR、Halo-HMSiR等系列衍生物,分别能够高特异性标记目标亚细胞器或融合蛋白;生物学标记与成像研究表明,利用上述靶向型染料分别获得了高分辨率的亚细胞微观结构。