血管新生是机体众多生理和病理现象的关键步骤,如胚胎发生、创伤修复和癌症等。血管新生这一复杂的过程需要大量促进和抑制血管生成的细胞因子协同作用来完成。血管生成素(Angiogenin, Ang)是其中的重要成员之一,它能有效地起始和促进肿瘤组织血管的形成,加速肿瘤的发展和转移。前期研究证实,Ang与FHL3存在相互作用。FHL3(four and a half LIM domain protein 3)是LIM蛋白家族成员,由四个半LIM结构域组成。LIM结构域由两个锌指结构串联构成,包含特征性的氨基酸保守序列(CX2CX17-19HX2CX2CX16-20C/H/D)。FHL3在肌细胞形成,骨骼肌分化,细胞骨架动力学等方面都具有重要作用。近年来,FHL3的其它生物学功能如调控细胞周期的功能被发现并得以研究。本课题以FHL3与Ang的相互作用为切入点,主要应用酵母双杂交,三杂交等方法,以揭示FHL3的结构与功能的关系,及其在血管新生调控中的作用。本研究从人脾cDNA文库中获得了FHL3的全长基因序列,并首次在原核表达系统中实现了高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在。采用镍柱亲和层析对表达产物进行了纯化,获得了较高纯度的FHL3蛋白,并对纯化蛋白进行了透析复性。Western blot实验结果显示重组蛋白能与抗FHL3多抗发生特异性反应。细胞学实验表明,纯化的FHL3蛋白对肝癌细胞HepG2有抑制增殖的作用。其作用的机制有待进一步研究来阐明。为了寻找FHL3的相互作用蛋白,我们利用酵母双杂交系统对人胎肝cDNA文库进行了筛选,发现了一个具有相互作用的候选蛋白,该蛋白氨基酸序列与金属硫蛋白MT1X有60%的一致性。进一步钓取了MT1X的全长基因,构建到AD质粒pACT2上,验证了两者的相互作用。MT1X是金属硫蛋白(metallothionein,MT)10个功能亚型的一种, MT参与许多病理过程,包括金属离子稳态和解毒、防护氧化损伤、细胞增殖和凋亡。研究表明,MT-1X异常的高水平表达与乳腺癌发生、发展密切相关,但目前MT-1X的具体作用机制尚不清楚。FHL3与MT1X相互作用的发现及深入研究,将使我们进一步了解MT1X的相关功能。在研究FHL3功能的过程中我们发现其具有转录激活活性。为了定位FHL3的转录激活结构域,构建了FHL3各个LIM结构域分别缺失的系列突变体。在酵母细胞中验证了它们的表达之后,利用酵母双杂交系统确定了FHL3蛋白N端第4个LIM结构域与转录激活活性有关。通过构建缺失突变体,进一步将转录激活结构域定位到FHL3第4结构域的C端锌指,即整个FHL3蛋白的最后一个锌指结构。通过对比FHL3与FHL2的LIM4结构域上的氨基酸序列,发现两者在长度上一致,氨基酸的同源性也有56%。考虑到两者在一些位点上氨基酸虽然不同,但性质相近,对功能影响也类似。若加上这类氨基酸的话,两LIM结构域的相似度则达到76%。而研究表明,FHL2的LIM4也是与其转录激活活性有关。两者在结构与氨基酸组成上的相似也暗示它们在功能上的关联。为了进一步研究Ang与FHL3相互作用对血管新生的影响,我们构建了重组质粒pBridge-Ang-FHL3,应用酵母三杂交系统,以FHL3与Ang复合物为诱饵,进一步筛选可能的相互作用蛋白,在已进行的三轮筛选中尚未发现阳性克隆。利用构建的FHL3系列突变体,我们研究了FHL3与Ang结合的分子结构域,为通过蛋白模建分析两者结合区及结合关键氨基酸提供了线索。综上所述,1)获得了全长基因的FHL3,实现了其在原核表达系统中的高效表达,经纯化、复性后,获得具有生物活性的重组蛋白;2)发现重组FHL3可抑制HepG2细胞增殖;3)筛选到了FHL3的相互作用蛋白-金属硫蛋白MT1X;4)构建了缺失不同LIM结构域的FHL3系列突变体,确定了FHL3的自转录激活结构域;5)利用FHL3系列突变体研究了FHL3与Ang相互作用的分子结合域。总之,FHL3的结构与功能研究为我们进一步了解其生物学功能,特别是在揭示其与Ang相互作用对血管新生的影响方面提供了线索。