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研究背景随着肿瘤发病率和死亡率的逐年升高,恶性肿瘤已成为威胁人类健康最主要的疾病之一。据统计,2014年美国将有1,665,540例新发癌症患者,其中585,720例将死于恶性肿瘤。在美国女性中,乳腺癌的发病率占恶性肿瘤的第一位,死亡率居恶性肿瘤第二位。转移是恶性肿瘤最显著的生物学特征,是临床上大多数肿瘤患者治疗失败和致死的最主要原因。肿瘤转移是多步骤、多因素参与的极其复杂的过程,它受到肿瘤本身和宿主环境等多因素的影响。1889年,Paget率先提出了“种子和土壤”学说,即癌细胞(种子)需要适当的微环境(土壤)生长、浸润和转移,他认为肿瘤微环境在肿瘤进展过程中具有重要作用。炎症是目前已证实的能通过细胞因子、趋化因子、活化氧等调节肿瘤细胞活性来促进转移的环境因素。近年来,随着对恶性肿瘤发生发展机制的深入研究,人们越来越认识到炎性微环境在乳腺癌转移过程中发挥重要作用,炎症与肿瘤转移的关系成为人们研究的热点之一,但其机制目前仍不清楚。本研究通过建立炎症动物模型、乳腺癌肺转移模型及体外实验等研究,旨在探讨炎症在乳腺癌肺转移过程中的作用及可能的机制。研究方法将50只雌性BALB/c小鼠随机分为5组：①PBS组：腹腔注射磷酸盐缓冲液(PBS)；②LPS组：腹腔注射脂多糖(LPS)；③PT组：腹腔注射PBS+尾静脉注射4T1细胞；④LT组：腹腔注射LPS+尾静脉注射4T1细胞；⑤LTC组：腹腔注射LPS+尾静脉注射4T1细胞+腹腔注射塞来昔布(Celecoxib, Cele)。其中,PBS组和LPS组：连续3天腹腔注射PBS或LPS (5mg/Kg/d),第4天处死小鼠收集标本；PT组、LT组及LTC组：PT组连续3天腹腔注射PBS, LT组和LTC组连续3天腹腔注射LPS,三组小鼠均于第3天腹腔注射PBS/LPS后4小时给予尾静脉注射乳腺癌4T1细胞1×105/只,第4天起PT组、LT组给予腹腔注射PBS, LTC组给予腹腔注射塞来昔布5mg/kg/d治疗,4周后处死小鼠。所有小鼠眼球取血法收集血清,采用酶联免疫法(ELISA)测定血清血管内皮生长因子(VEGF)、前列腺素E2(PGE2)水平,收集肺组织做病理染色,采用免疫荧光CD31染色比较小鼠肺组织血管的变化,PT组、LT组及LTC组观察肺转移瘤并计数。提取各组小鼠肺组织蛋白,检测VEGF、环氧合酶-2(COX-2)表达水平。体外,4T1细胞给予不同浓度LPS刺激24小时后,使用四甲基偶氮唑盐比色(MTT)方法检测细胞增殖能力。分离正常小鼠的肺血管内皮细胞(MPVEC)并培养,使用VEGF、PGE2. Cele刺激Matrigel基质胶上培养的MPVEC,观察内皮细胞血管生成情况。给予PGE2、PGE2受体激动剂、PGE2受体拮抗剂刺激MPVEC后,ELISA方法检测MPVEC培养上清液中VEGF表达水平,使用Western blot方法检测细胞的VEGF蛋白表达。所有实验数据结果以均数±标准差(x±s)来表示,采用SPSS16.0统计学软件进行统计分析,两样本比较采用t检验,P<0.05为有统计学意义。研究结果1.LPS诱导全身炎症反应LPS组小鼠第2天开始精神萎靡,双眼发红,毛发蓬乱,逐渐消瘦；PBS组小鼠反应敏捷,毛发光亮。LPS组小鼠肺脏体积较PBS组大,明显水肿、充血,肺组织苏木精-伊红染色(HE染色)显示LPS小鼠肺泡壁中断,肺泡腔可见炎性渗出,毛细血管充血扩张。2.LPS促进肺血管生成小鼠肺血管生成情况使用CD31免疫荧光共聚焦显微镜观察,结果显示LPS组小鼠的肺血管走行迂曲、紊乱,血管丛较密集、扭曲,管腔之间相互交通,PBS组小鼠肺血管规则、有序,LPS组小鼠肺血管密度明显大于PBS组。LTC组小鼠给予腹腔注射塞来昔布(5mg/kg/d)治疗,肺组织中CD31阳性细胞较未治疗组(LT组)小鼠明显减少,血管丛规则、有序,密度减小。3.LPS促进乳腺癌肺转移HE染色显示,LT组小鼠肺组织转移瘤数目和浸润区域均明显大于PT组。显微镜下计数肺转移瘤,LT组小鼠肺转移瘤数目平均为(37.5±4.3)个,明显大于PT组(12.1±3.5)个,两组比较差异有统计学意义(P<0.01LTC组小鼠给予塞来昔布治疗后,肺转移瘤数目较未治疗组(LT组)明显较少,肿瘤浸润区域小于LT组。4.LPS对4T1细胞的增殖无明显影响不同浓度的LPS (Oug/ml、10ug/ml、100ug/ml)刺激4T1细胞24小时后,使用MTT方法检测细胞增殖能力。结果显示,LPS刺激对4T1细胞增值能力的影响无统计学意义(P<0.05)。5.LPS促进VEGF的产生不同浓度的PGE2(10nM、100nM、200nM)刺激MPVECs24小时后,细胞培养上清液及细胞蛋白中VEGF水平随PGE2刺激浓度增加而升高。各组小鼠血清中的VEGF、PGE2水平使用ELISA方法检测,结果显示,LPS组小鼠血清中VEGF、PGE2水平明显高于PBS组,LT组小鼠血清中PGE2和VEGF水平均明显高于PT组,而塞来昔布治疗的LTC组小鼠血清中生长因子水平均较未治疗组(LT组)明显下降。6. Celecoxib处理MPVECs抑制VEGF诱导的血管生成体外血管生成实验显示,单独使用Celecoxib处理MPVECs,内皮细胞在Matrigel基质胶上形成的管样结构数目较对照组(DMEM培养基)减少；单独使用PGE2、VEGF刺激MPVECs后,内皮细胞形成的管腔样结构生成增多。内皮细胞中先加入PGE2/VEGF,再加入Celecoxib,则PGE2、VEGF的促血管生成作用受到抑制。7.LPS通过PGE2-EP2通路促进VEGF产生PGE2的4种特异性EP受体激动剂处理内皮细胞后,EP2受体激动剂能使上清液中VEGF水平升高,而EP1、EP3、EP4受体激动剂对VEGF水平无明显影响。EP2受体拮抗剂能使MPVEC培养上清液中VEGF水平下降。结论1.LPS诱导VEGF产生,从而促进血管生成和乳腺癌肺转移。2.PGE2促进血管内皮细胞产生VEGF是通过PGE2-EP2受体通路介导。