随着养牛场规模化程度不断加深,牛呼吸道疾病日益频发,给世界范围内的养牛业造成了巨大的经济损失。奶牛肺炎是最常见的牛呼吸道疾病之一,其对奶牛养殖业的危害已逐步显现出来,严重威胁了畜牧业的健康长远发展。引起奶牛肺炎的病原微生物有很多,其中细菌性病原具有发病快、传染性和致病力强、危害大等特点,是导致奶牛肺炎发生并能造成严重后果的主要传染性病原。尽管近年来我国对奶牛细菌性肺炎的研究不断深入,但致病菌的特性、细菌感染的致病机理和肺炎的发病机制尚不十分明确。这使得奶牛肺炎的治疗手段存在较大局限性,临床上主要采用大剂量抗生素进行治疗。而抗生素的过度使用,极易造成大量残留以及耐药基因、多重耐药性菌株的快速出现。如今,许多国家已经严格限制或禁止兽用抗生素的使用。Micro RNA是一类参与转录后基因表达调控的小分子RNA,在多种生物学过程和疾病的发生发展中发挥重要作用。mi R-182属于mi R-183基因簇,可以在急性肺损伤、动脉粥样硬化以及多种炎症反应中发挥重要的调节作用。然而,目前关于mi R-182在奶牛细菌性肺炎中的作用和调控机制尚不明确。本文以奶牛炎性肺组织为研究对象,从验证mi R-182的靶基因入手,深入探究mi R-182在奶牛肺脏炎性应答中的作用和机制,为临床上奶牛肺炎的防治提供新的思路和方向。主要研究内容和试验结果如下:(1)通过临床诊断选取健康和有明显呼吸道症状且剖检可见肺部炎症病变的奶牛,采集肺组织。经过肺脏病理组织学观察、MPO活性和ELISA检测发现,患病奶牛肺组织出现以弥漫性肺间质和肺泡水肿、肺泡腔内大量炎性细胞渗出为特征的肺损伤,MPO活性显著增加,且炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达水平显著升高,说明患病奶牛肺组织有严重的炎性损伤。RT-q PCR检测发现,TLR4在奶牛炎性肺组织中显著升高,而mi R-182却显著降低。采用16S r RNA序列分析确证,常规分离鉴定10株细菌全部为大肠杆菌。将分离的大肠杆菌人工感染10组小鼠,结果显示,其中8组小鼠在感染后短时间内全部死亡,其它2组表现出不同程度的致病性;剖检死亡小鼠发现,小鼠的肺脏充血、局部出现坏死灶,证明分离得到的大肠杆菌具有强致病性。以上结果提示,mi R-182在大肠杆菌性肺炎中具有重要意义,可能与TLR4/NF-κB信号通路有关。(2)利用生物信息软件预测mi R-182可能的靶基因及靶点碱基配对,初步确定TLR4为mi R-182的靶基因。通过双荧光素酶报告试验进行验证发现,mi R-182显著抑制TLR4 3’-UTR荧光素酶活性,并且过表达mi R-182明显降低RAW264.7细胞中TLR4转录和翻译水平,证实TLR4是mi R-182的靶基因,且mi R-182与TLR4的表达呈负相关。(3)为了进一步探究mi R-182在炎性应答中的分子机制,通过CCK8实验检测LPS对巨噬细胞系(RAW264.7)细胞的毒性发现,细胞活力并不受LPS的影响。使用LPS建立体外RAW264.7细胞炎症模型,并且采用RT-q PCR检测相关基因。结果显示,mi R-182与LPS呈时间和剂量依赖式下调。在RAW264.7细胞中转染mi R-182模拟物可显著降低IL-1β,IL-6和TNF-α等促炎因子的表达;而相反,转染mi R-182抑制剂可明显增加促炎因子的表达。此外,Western blot和间接免疫荧光结果显示,在LPS刺激的过表达mi R-182的RAW264.7细胞中,NF-κB信号通路的活性、IκBα的磷酸化水平以及磷酸化的p65入核均被显著抑制。这些数据提示mi R-182对LPS诱导的炎症反应有负调控/抑制作用。为进一步阐明mi R-182是否通过抑制TLR4发挥抗炎作用,本研究使用si RNA技术干扰TLR4表达进行体外验证,结果发现,si RNA干扰显著抑制了RAW264.7细胞中促炎性因子水平和LPS诱导的NF-κB-p65磷酸化水平,与过表达mi R-182的结果完全一致。这些试验结果表明mi R-182通过靶向抑制TLR4减轻LPS诱导的细胞炎症损伤。(4)为进一步验证mi R-182对肺炎组织炎症损伤的影响,本文构建了LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型,结果显示,mi R-182在急性肺损伤小鼠的肺组织中表达显著下调,与奶牛炎性肺组织中的结果完全一致,提示mi R-182对小鼠急性炎性肺损伤具有保护作用。综上所述,本研究的试验结果表明,mi R-182通过靶向TLR4抑制NF-κB信号通路触发的级联效应,保护并减轻炎症反应对奶牛肺脏的损伤。