论文部分内容阅读
桦木酸、齐墩果酸等三萜酸类化合物具有抗肿瘤、抗HIV、保肝等多种药理活性,已被广泛地应用于医疗保健领域。从天然植物直接提取或化学合成三萜酸类化合物的方法存在破坏生态环境、收率低、高能耗等问题。近年来,微生物发酵法因成本低、环境友好而备受关注。酿酒酵母为安全的模式生物,具有遗传背景清晰,遗传操作简单及大规模发酵技术成熟等优势,利用重组酿酒酵母发酵生产植物源天然药物已成为微生物发酵法的研究热点。为获得生产桦木酸的酿酒酵母细胞工厂,本研究首先在三萜底盘细胞BY-T3的rDNA多拷贝位点引入乌拉尔甘草来源的羽扇豆醇合酶基因(LUP)及MVA途径限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(tHMGl),初步获得了可生产桦木酸前体羽扇豆醇的底盘细胞BY-LUP02,其在YPD培养基中发酵6天后,羽扇豆醇产量可达到117.4mg/L。在此基础上,本研究分别组合拟南芥来源细胞色素P450还原酶1(AtCPR1)及3种不同来源的细胞色素P450酶,筛选得到了催化活性最高的葡萄来源的P450酶(CYP15)。为进一步提高工程菌株的桦木酸产量,本研究筛选了7种不同来源的细胞色素P450还原酶(CPR),得到了效果最佳的拟南芥来源细胞色素P450还原酶2(AtCPR2),最终获得了一个高产桦木酸的细胞工厂BY-BA42(12.7 mg/L)<在前期研究中,实验室已经成功构建出生产齐墩果酸的酿酒酵母细胞工厂BY-OA,但经代谢物分析发现前体物质鲨烯还有很高的积累(141.2mg/L)。为进一步提高鲨烯转化为齐墩果酸的能力,本研究在BY-OA的基础上增加下游关键基因(光果甘草β-香树脂合成酶GgbAS,蒺藜状苜蓿齐墩果酸合成酶MtOAS和AtCPRl)拷贝数后得到的第二代齐墩果酸工程菌株BY-2O A,其在含初始葡萄糖浓度为20g/L的YPD培养基中发酵7天后,β-香树脂和齐墩果酸产量分别提高54%和30%,达到136.5mg/L和92.5 mg/L;通过进一步碳源优化,BY-2OA在初始葡萄糖浓度为40 g/L的YPD培养基中发酵7天可生产165.7 mg/L的齐墩果酸。本研究利用合成生物学手段构建出生产桦木酸及齐墩果酸的酿酒酵母细胞工厂,并通过进一步优化提高了桦木酸与齐墩果酸的生产能力,为重组微生物发酵法取代植物提取和化学合成三萜酸类化合物提供了基础。