乳腺生物反应器具有蛋白活性高、产量大、易收集、污染低等优势,利用转基因技术在乳腺生产目的药用蛋白已成为全球研究热点。人源性凝血因子八(FⅧ)是预防和治疗甲型血友病的有效药品。国产FⅧ均为血浆提取浓缩制品,无重组FⅧ的药品。本课题拟采取显微注射方法生产携带人重组凝血因子八转基因小鼠乳腺生物反应器,此次研究结果将为转基因大动物的生产提供科学依据。本课题将两种乳腺特异性表达调控序列(β-酪蛋白启动子、αS1-酪蛋白启动子)的FⅧ表达载体,通过原核注射的方法,注射到小鼠原核中,构建转基因小鼠。以此分析两种表达载体的表达特性。将两种乳腺特异性表达调控序列载体在大肠杆菌中扩增。β-酪蛋白启动子所在的pBC1-rhFⅧ载体用SalⅠ与NofⅠ酶切,αS1-酪蛋白启动子所对应的807-1载体用NotⅠ酶切,经胶回收试剂盒纯化获得完整的表达序列。而通过显微注射方法,将表达调控序列导入受体胚胎原核,注射胚胎移植到同期假孕雌鼠,受体妊娠自然分娩仔鼠。PCR方法检测其转基因整合情况。将检测到的阳性鼠(首建鼠F0),与正常小鼠合笼繁殖,获得子代鼠(F1)。应用ELISA和Western blot,对上述转基因阳性小鼠乳汁进行表达水平的检测。结果显示pBC1-rhFⅧ载体片段原核显微共注射454枚胚胎,移植存活的405枚胚胎,获得出生仔鼠95只,PCR检测出阳性小鼠12只;807-1载体片段注射了705枚胚胎,移植存活的535枚胚胎,获得出生仔鼠124只,PCR检测出阳性小鼠9只。pBC1-rhFⅧ载体整合效率为12.6%,高于807-1载体的7.3%,无显著差异。F0代乳汁ELISA分析中,两种基因型的转基因小鼠表达均可见FⅧ表达。pBC1-rhFⅧ转基因小鼠检测到4只F0表达FⅧ因子,平均表达水平为0.22 IU/mL。807-1转基因小鼠检测了 3只,平均表达水平为0.19 IU/mL。Western blot定性检测显示,两种转基因小鼠乳汁均显示出目标条带80KDa,验证了 ELISA的结果。研究表明两种表达载体均可制备转基因小鼠,均能指导重组FⅧ在乳汁中特异性表达;转基因基因型能传递给后代。