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背景:孢子丝菌病是由双相型真菌申克孢子丝菌复合体(Sporothrix schenckii complex)感染引起的常见深部真菌病,在世界各地广泛流行,可累及皮肤甚至造成系统性感染,迁延不愈。最近分子生物学研究发现申克孢子丝菌是由6个亲缘种构成的复合体,包括狭义的申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii sensu stricto)、巴西孢子丝菌(Sporothrix brasiliensis)、球形孢子丝菌(Sporothrix globosa)、卢艾里孢子丝菌(Sporothrix luriei)、墨西哥孢子丝菌(Sporothrix mexicana)和苍白球孢子丝菌(Sporothrix pallida)。球形孢子丝菌是我国孢子丝菌病的主要优势菌种,然而我国不同地区来源的临床菌株表型仍存在差异,且部分研究表明存在一定的遗传变异性,因此深入研究球形孢子丝菌是否存在基因型、表型特征、药物敏感性等的差异具有重要意义。目的:对我国不同地区孢子丝菌病的临床分离株进行种系发生分析及表型特征分析,利用扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism,AFLP)研究我国不同地区来源的球形孢子丝菌临床分离株基因多态性,并探讨其与临床分型、地理来源、药物敏感性及菌株生长速度的相关性。方法:1.收集2009年至2013年来自中国8个不同省市孢子丝菌病的225株临床分离株及患者临床资料。对所有临床分离株的钙调蛋白(CAL)基因片段进行扩增并测序,将CAL序列上传至Genbank数据库进行比对,利用MEGA 6.0软件,采用Neighbor-Joining法进行系统进化分析构建种系发生树。2.通过限制性内切酶组合Eco RⅠ和Saq AⅠ,对AFLP分析中各实验步骤进行优化,并用64对引物进行筛选,选取1对DNA多态性较好的引物;采用优化后的AFLP反应体系,对225株临床分离株进行AFLP分析,利用NTSYS-pc version 2.10对结果进行聚类分析。3.将225株临床分离株接种于马铃薯琼脂培养基(PDA)中,分别置于30℃、35℃和37℃温箱中,于7天、14天、21天分别观察菌落直径,计算生长速度;同时将临床分离株进行碳源同化实验。4.参照Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)颁布的微量液基稀释法M38-A2方案,选用临床分离株的菌丝相,对来源于不同AFLP基因型别,分别包括Ⅰ型(n=10)、Ⅱ型(n=10),Ⅲ型(n=2)、Ⅳ型(n=9)、Ⅴ型(n=4)、Ⅵ型(n=2)、Ⅶ型(n=3)、Ⅷ型(n=3),共43株临床分离株进行体外药物敏感性实验,检测的抗真菌药物包括氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、特比萘芬、两性霉素B、泊沙康唑、卡泊芬净、阿巴康唑。结果:1.建立球形孢子丝菌AFLP反应的最佳体系:约1000ng模板DNA经限制性内切酶Fast Digest Eco RⅠ与Fast Digest Saq AⅠ(各1U),37℃酶切5min;取8μl酶切液加入1μl Eco RⅠ接头、1μl Saq AⅠ接头、T4DNA连接酶2.5U,25℃连接1h;20μl扩增体系,取稀释20倍的连接产物5μl,加入Mg2+2m M、Taq酶1U、d NTPs 0.2m M each、引物0.1μM;20μl扩增体系,取稀释20倍的预扩增产物5μl,加入Mg2+1m M、Taq酶1.5U、d NTPs 0.15m M each、引物0.06μM。选择性扩增引物采用E4:GACTGCGTACCAATTCACT,M1:GATGAGTCCTGAGTAACAA效果较好。2.通过对225株临床分离株的CAL基因序列鉴定,结果显示所有菌株均为球形孢子丝菌,系统进化树显示各地区的球形孢子丝菌可分为3个Subgroup(命名为globosaⅠ,globosaⅡ,globosaⅢ),globosaⅠ最常见,首次发现globosaⅢ。AFLP聚类分析可得到8个区分明显的型别(命名为I至Ⅷ),其中Ⅰ型(23%)、Ⅱ型(41%)和Ⅳ型(22%)最为常见。来自长春的临床分离株主要分为Ⅱ型(35/60)和Ⅳ型(25/60),四平的临床分离株主要聚类于Ⅱ型(23/31),吉林市的临床分离株(18/20)和白城的临床分离株(12/13)以Ⅰ型为主,Ⅲ型(n=2)和Ⅷ型(n=3)全部为松原的临床分离株。AFLP基因分型和地理来源之间存在一定的相关性,但并未发现与临床分型的相关性。3.所有球形孢子丝菌在PDA上于30℃培养21天后,菌落直径达16~42mm,于35℃培养21天后,菌落直径达3~15mm,而大部分临床分离株(218/225)在37℃呈限制性生长(菌落直径达1.5~5.5mm),少数(7/225)不能生长;所有球形孢子丝菌临床分离株均能同化蔗糖不能同化棉子糖;对于球形孢子丝菌的菌丝相,特比萘芬表现最好的抗真菌活性,MIC值为0.03~8μg/ml,GM值为0.05μg/ml;其次为泊沙康唑、阿巴康唑、卡泊芬净,MIC值分别为0.5~>16μg/ml、4~16μg/ml、0.25~>16μg/ml,GM值分别为2.99μg/ml、8.26μg/ml、9.55μg/ml;而伊曲康唑、伏立康唑、两性霉素B、氟康唑的MIC值均较高,分别为1~>16μg/ml、8~>16μg/ml、>16μg/ml、>64μg/ml。统计学分析显示,每种抗真菌药对不同临床分型、不同基因型别、不同地理来源的球形孢子丝菌的MIC值无明显差异。结论:1.球形孢子丝菌为我国孢子丝菌病的主要致病菌种。2.在种系发生上,球形孢子丝菌可进一步分为3个亚组。我国globosaⅠ最常见,首次发现globosaⅢ。3.采用AFLP方法,利用Eco RⅠ-ACT/Saq AⅠ-CAA引物可将球形孢子丝菌分为8个主要基因型别。孢子丝菌病的临床分型与AFLP基因分型无相关性。4.中国南北区域的球形孢子丝菌AFLP基因分型有明显的地域分布特征,其中吉林省的基因分型与省内城市分布有一定的相关性。5.大部分球形孢子丝菌在37℃呈限制性生长,仅有少数不能生长;球形孢子丝菌能同化蔗糖,不能同化棉子糖;八种抗真菌药物中,特比萘芬的抗真菌活性最高,其次为泊沙康唑、阿巴康唑、卡泊芬净,而伊曲康唑、伏立康唑、两性霉素B、氟康唑的MIC值均较高。球形孢子丝菌对药物的敏感性与孢子丝菌病致病的临床分型、菌株的基因分型、地理来源无关。