黄瓜土传枯萎病是黄瓜连作生物障碍的主要病害之一,严重影响黄瓜产业的发展,研究利用生物防控为主导的综合防控具有重要意义。解淀粉芽孢杆菌SQR9是本实验室从黄瓜种植发病区的健康植株根际分离的一株根际促生菌,能强烈抑制土传枯萎病病原真菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum J. H. Owen,FOC),在盆栽和大田试验中表现出显著的促生和生防效果。本文紧紧围绕生物防控的两个主要部分：拮抗机理和根际定殖机理开展了一系列的研究。首先研究了SQR9在实验室条件下拮抗黄瓜枯萎病病原真菌尖孢镰刀菌的机理,发现一种抗生素物质同时影响了SQR9拮抗活性和生物膜的形成；然后通过转录组技术,研究了这种抗生素物质影响SQR9生物膜形成和根际定殖行为的机理；最后利用分子生物学手段,研究了全局性调控因子DegU影响SQR9生物膜形成、根际定殖能力和主要抗真菌抗生素产量的内在规律；同时,研究了黄瓜根际影响SQR9生物膜的环境信号,将成熟的芽孢杆菌生物膜形成机制与根际定殖机理结合。主要研究结果有以下几点：1.通过液质联用的方法鉴定出SQR9发酵液两种脂肽类抗生素bacillomycin D和fengycin有拮抗黄瓜枯萎病病原真菌活性,基因定点敲除了bacillomycin D和fengycin的合成基因6amD (SQR9M1)和fenA (SQR9M2)后,SQR9M2的发酵液仍然对黄瓜枯萎病病原真菌有强烈的拮抗活性(抑制率为96%),与野生型SQR9发酵液类似(抑制率为98%),而SQR9M1的发酵液对黄瓜枯萎病病原真菌仅剩40%的抑制率。证明bacillomycin D是SQR9拮抗黄瓜枯萎病病原真菌的主要活性物质。2.首次发现bacillomycin D能影响SQR9生物膜形成和根际定殖过程,定性和定量的结果表明突变体SQR9M1在生物膜形成前期,其生物膜形成能力显著低于野生型,外源添加液相收集的bacillomycin D后生物膜形成能力恢复。运用荧光定量PCR的方法证明,在SQR9生物膜形成前期bacillomycin D突变体影响了生物膜相关基因yqxM、kinC和epsD的表达,外源加入液相收集的bacillomycin D后生物膜相关基因的表达均能恢复,但外源添加钾离子没有作用。深入的研究发现,bacillomycin D影响SQR9生物膜的机理和另一种脂肽类抗生素surfactin影响生物膜的机理不同,存在新的机制。黄瓜根际定殖的结果表明突变体SQR9M1在黄瓜根际定殖前期,定殖数量显著低于野生型SQR9和突变体SQR9M2,同样外源添加液相收集的bacillomycin D后突变体SQR9M1的根际定殖能力恢复。3.通过转录组技术分析了突变体SQR9M1和野生型SQR9生物膜形成24h时基因的表达差异。分析结果表明,一共有1261个基因表达发生改变,其中574个基因上调(P<0.01),687个基因下调(P<0.01)。从基因功能上看,功能明确的基因约占全部差异基因数量的70%,变化最大的基因功能类群是无机离子转运和代谢。在这部分基因中,大量的ABC转运蛋白表达被显著调控,特别是与铁离子转运相关的ABC转运蛋白,有9个基因被显著下调,几乎包含了在芽孢杆菌中已报道的所有铁运输的基因,其中包括FhuBGC、FeuABC和YfmCDEF三个铁ABC转运系统。选取了部分铁离子ABC转运蛋白合成基因和生物膜相关基因进行定量PCR验证,结果和转录组的结果一致。低浓度的铁离子能促进SQR9生物膜的形成,而高浓度的铁离子抑制SQR9生物膜的形成。外源添加适当浓度的铁离子后,能恢复突变体SQR9M1形成生物膜的能力。4.根据SQR9的全基因组序列及其注释,找到了五个铁离子运输ABC转运蛋白：YwbMNL、YfmCDEF、FhuBGC、YfiYZ和FeuABC。将这五个ABC转运蛋白的基因定点敲除后,首次发现突变体ΔfeuBC和ΔyusV(基因feuBC和yusV分别是铁离子ABC转运系统FeuABC的Permease和ATPase)显著影响了菌落形态和生物膜形成。突变体AfeuBC的菌落始终非常水润,和野生型SQR9培养12 h时的菌落形态一致,即使在培养后期,菌落表面也不能形成褶皱状的高级结构。突变体ΔyusV前期和突变体ΔfeuBC一样,菌落非常水润,但到了培养后期,其菌落部分地方形成了类似野生型菌落后期的高级结构,菌落形态处于突变体ΔfeuBC和野生型SQR9的中间状态。定性和定量的结果表明,突变体ΔfeuBC和ΔyusV失去了大部分形成生物膜的能力,特别是突变体ΔfeuBC,几乎不能形成生物膜。定量PCR的结果表明,外源添加bacillomycinD和10μM氯化铁后,SQR9内铁离子转运基因和生物膜形成相关基因有相同的变化规律(都显著上调),突变体ΔfeuBC和ΔyusV内的铁离子转运基因和生物膜形成相关基因失去了响应bacillomycin D和10 μM氯化铁的能力。生物膜调控基因突变体Δsinl和ΔtasA在菌落形态和生物膜形成能力上分别和突变体ΔyusV和ΔfeuBC相似。定量PCR的结果发现,突变体ΣyusV和ΣfeuBC中TasA蛋白的合成基因yqxM显著下调,这是突变体ΔyusV和ΔfeuBC影响菌落形态和生物膜形成的主要原因。成功异源表达了ABC转运蛋白FeuABC的基质绑定蛋白FeuA,发现蛋白FeuA能和脂肽类抗生素bacillomycin D特异性结合,推测bacillomycin D是通过ABC转运蛋白FeuABC影响生物膜形成。5.成功构建了SQR9不同DegU磷酸化水平的的三株衍生菌：SQR9M4(低磷酸化水平),SQR9Q(中等磷酸化水平)和SQR9SUQ(高磷酸化水平)。在MSgg固体培养基上,随着调控蛋白DegU磷酸化水平的升高,菌落的褶皱和空间结构都变得更加复杂。突变体SQR9M4的菌落比较平滑,几乎看不到褶皱,而菌株SQR9SUQ的菌落褶皱复杂,空间结构丰富,菌落呈现类似火山口形状的堆积,纵向高度比SQR9和SQR9M4的菌落显著增加,说明调控蛋白DegU磷酸化水平影响了SQR9菌落的空间结构。在MSgg液体培养基中,随着调控蛋白DegU磷酸化水平的升高,生物膜形成能力也逐步增强。突变体SQR9M4形成生物膜的能力显著降低,表面几乎没有褶皱。菌株SQR9SUQ的生物膜形成能力最强,结构紧密,表面褶皱丰富。根际定殖结果表明,随着调控蛋白DegU磷酸化水平的升高,菌株根际定殖的能力显著提高。分离纯化并鉴定了SQR9发酵液中六种抗生素类物质bacillomycin D、fengycin、surfactin、 macrolactin、difficidin和bacillaene。定量PCR和HPLC的结果表明DegU磷酸化水平最高的菌株SQR9SUQ中bacillomycin D和difficidin这两个抗生素的产量显著高于菌株SQR9M4,随着DegU磷酸化水平的增高,这两个物质的产量也随之增加。DegU磷酸化水平最低的菌株SQR9M4中macrolactin和bacillaene的产量相比于野生型SQR9和菌株SQR9SUQ都显著提高,随着DegU磷酸化水平的升高,这两个物质的产量呈下降趋势。Fengycin和surfactin这两个脂肽类抗生素的产量和DegU磷酸化水平没有显著关系。盆栽试验证实,DegU磷酸化水平最高的菌株SQR9SUQ因为根际定殖能力强并且bacillomycin D产量高,所以具有较好的防控黄瓜枯萎病的能力。6.在MSNc培养基中,SQR9生物膜形成能力显著高于枯草芽孢杆菌168,3610和解淀粉芽孢杆菌FZB42。黄瓜根系分泌物和根系细胞提取物都能诱导SQR9的生物膜形成。突变体ΔsinI和Δspo0A丧失了感知根系细胞提取物的能力,而突变体ΔdegU丧失了感知根系分泌物的能力,将突变体ΔdegU和Aspo0A混合培养恢复了对黄瓜根系分泌物和根系细胞提取物的响应。植物多糖(阿拉伯糖、果胶和木聚糖)能诱导SQR9生物膜的形成。成功异源表达了生物膜调控蛋白DegU。