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本研究以广西巴马小型猪的成纤维细胞(Porcine Fetal Fibroblasts, PFF)、骨髓间充质细胞(Porcine Bone marrow Menenchymal Stem Cells, PBMSCs)和脂肪干细胞(Porcine Adipose-derived Stem Cells, PASCs)为材料,通过四环素(Doxycycline, DOX)诱导型慢病毒载体将Oct4、Sox2、 c-Myc、Klf4、Lin28、Nanog导入不同种类细胞中,比较不同种类细胞和不同培养基条件下的重编程效率,并对获得的类克隆进行生物学鉴定。同时,在培养基中添加p38和JNK通路抑制剂SB203580和SP600125,以期获得原始态(Na(?)ve)的猪诱导多能干细胞(porcine induced Pluripotent Stem Cells, piPSCs)。研究结果总结如下。1、广西巴马小型猪不同种类细胞和不同培养条件下重编程效率的比较。不同种类细胞经过病毒感染后,在人胚胎干细胞和诱导多能干细胞完全培养液即mTeSR培养条件下于感染后的D10-D12形成克隆,通过克隆形态观测和碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AP)染色计数,PBMSCs、 PASCs、PFF的重编程效率分别为0.28%、0.25%、0.23%,PBMSCs显著高于PFF, PASCs与PBMSCs、PFF之间无显著性差异,但在mTeSR培养条件下未获得稳定传代的细胞株。为改进培养条件,比较了PBMSCs在含bFGF、2i (PD0325901+ CHIR99021)+Lif和2i+Lif+bFGF培养基的克隆形成效率,发现PBMSCs在bFGF、2i+Lif、2i+Lif+bFGF的重编程效率分别为1.12%、0.84%、1.07%,bFGF、2i+Lif+bFGF显著高于2i+L if组,bFGF矛口2i+Lif+bFGF组间差异不盟著。为了确认最佳传代培养条件,分别挑取不I剖培养条件来源的PBMSCs-piPSCs克隆,使用相应培养基继续传代培养,并进一步检测其内源性基因的表达情况。结果发现,bFGF组克隆的内源基因Oct4、Klf4的表达量最低,从P10开始逐渐凋亡分化；2i+Lif组的克隆突起感较强,但生长缓慢,从P6开始逐渐停止增殖；2i+Lif+bFGF组的克隆内源基因Oct4、Klf4的表达量最高,传至P15克隆形态仍未发生改变,增殖较快。综合重编程效率、克隆传代次数及内源性基因的表达情况,2i+Lif+bFGF的培养条件对piPSCs克隆的获得和传代培养具有较好的效果。2、来自不同种类细胞的piPSCs的生物学特性鉴定。使用含2i+Lif+bFGF的培养条件获得来源于PBMSCs、PASCs、PFF 的 iPSCs克隆,然后对其进行生物学特性鉴定。结果发现,克隆呈碱性磷酸酶阳性;表达内源多能性相关基因Oct4、Sox2 及 E-cadherin、Dnmt3b、GDF3,同时表达Primed和Na(?)ve状态多能干细胞的候选标志基因FGF5和Klf4、 Klf5。去掉培养基中的DOX后,外源基因逐渐沉默,2i+Lif+bFGF的培养条件仍能持续传代培养piPSCs, piPSCs的增殖速率要高于对应的体细胞,PBMSCs、PASCs、PFF来源iPSCs的群体倍增时间分别为0.95d、0.93d、0.97d。核型分析结果显示：piPSCs核型正常率在70%以上,具有38条染色体；体外分化实验表明,piPSCs可形成拟胚体(Embryiod body, EB),并表达内、中、外三胚层的标记性基区I,具有体外分化潜能。以上结果表明,不同种类细胞来源的piPSCs具有Primed和Na(?)ve状态多能干细胞的特征。3、SB203580和SP600125促进piPSCs向Na(?)ve状态转变的初步研究。在2i+Lif+bFGF的基础上添加p38和JNK通路抑制剂SB203580和SP600125,以期获得接近于Na(?)ve状态的piPSCs o采用cck-8试剂盒检测不同浓度SB203580、SP600125对PBMSCs增殖的影响,最终采用5μM浓度的SB203580和SP600125用于后续实验。SB203580和SP600125(简称2s)联合2i+Lif+bFGF的培养条件,成功获得来源于PBMSCs的2s-piPSCs克隆。对其进行生物学特性检测表明,2s-piPSCs克隆呈碱性磷酸酶阳性；表达Na(?)ve状态多能干细胞的候选多能性相关基因Oct4、Sox2、 Klf4、Klf5、Rex1和S SEA1等,不表达Primed状态多能干细胞的候选基因FGF5; QRT-PCR结果表明该培养体系下的K1f4表达水平显著高于2i+Lif+bFGF和bFGF组的克隆；此外,2s-piPSCs可以使用胰蛋白酶进行消化传代,类似于小鼠胚胎干细胞的传代培养,可形成单克隆。以上结果表明,p38和JNK通路抑制剂SB203580和SP600125可以促进piPSCs向Na(?)ve状态转变,获得的2s-piPSCs克隆具有部分Na(?)ve状态多能干细胞的生物学特性。以上结果表明,PBMSCs重编程为piPSCs的效率较高,2i+Lif+bFGF的培养体系更适合于piPSCs的传代培养,p38和JNK通路抑制剂SB203580ⅡSP600125可以促进piPSCs向N faive状态转变,获得的2s-piPSCs具有部分Na(?)ve状态多能干细胞的特性。