动物繁殖生物（Animal Reproductive Biotechniques）在改善家畜遗传的研究和应用方面发挥着重要作用。体外胚胎生产（In vitro embryo production）已经被用于卵母细胞与胚胎发育过程的相关研究、为基础研究提供低成本胚胎、优良基因雌性种群繁育、与性别分选精子技术结合生产固定性别的胚胎,并应用于核移植与转基因动物生产等相关领域。在过去的几十年里,体外胚胎生产系统的效率得到了显著的改善,各种哺乳动物的囊胚发育、胚胎妊娠和出生率得到提高。然而,家畜体外胚胎生产的效率如果从卵母细胞算起,最终仍只有约5%的成熟卵母细胞能够产下活畜,因此这一技术仍被认为是低效的。导致体外胚胎发育障碍的主要原因之一有可能是体外培养体系的氧气环境引起的。通常,体外培养的胚胎体外胚胎一般在较高的氧气环境下培养发育（20%）,而雌性动物生殖道中的氧气浓度要低（2%-8%）。众所周知,常氧环境下的代谢过程会产生更多的活性氧（ROS）,而体外胚胎培养过程中活性氧水平的升高对胚胎发育有不良影响。在体内受精过程中,胚胎受到存在于输卵管和卵泡液中的活性氧清除剂的保护,但在体外培养系统则缺乏这些清除剂。在体外培养生产过程中,降低氧化应激的方法有多种,包括将氧降低到生理水平或在培养基中添加抗氧化剂。目前,利用不同氧气浓度培养胚胎已有一些研究报道,但胚胎发育过程中对氧的感应和调控机制仍不清楚。因此,本研究的主要目的是优化胚胎培养过程中的氧水平,了解胚胎发育过程中的氧感应和调控机制。首先,我们对单层细胞与血清为基础水牛胚胎培养体系进行优化,以便为开展氧气水平对胚胎发育过程的影响奠定基础。我们将水牛卵子与胚胎放入无血清与无单层细胞的培养体系（Serum and granulosa cell monolayer free culture system,SFCS）、有血清的培养体系（serum supplemented co-culture system,SSCS）以及优化的培养体系（Optimized culture system,OCS）中进行培养。在优化培养系统（OCS）中,卵子体外成熟过程是在有血清的情况下进行的,而胚胎发育过程则是无血清无单层细胞饲养层的情况下进行的。在OCS与SSCS（57.61±1.08 and 56.98±1.12）系统中,胚胎的的卵裂率比SFCS（52.62±0.88）系统高了4%左右。同时,相对于SFCS与SSCS系统而言,在OCS系统具备最多能发育到囊胚阶段（7d）与成功孵化（6d）的胚胎。另外,OCS促进了发育相关重要基因（BCL2-L1与VEGF-A）的表达,并对胚胎细胞数、胚胎存活能力与囊胚率具有良好的促进效果。因此,OCS系统在三种系统中更适合水牛胚胎的发育。其次,我们对低氧环境下影响胚胎发育的分子机制进行了相关研究。我们将水牛胚胎在5%（生理氧）或20%（常氧）氧气下培养,根据胚胎发育相关的形态学参数对胚胎发育情况进行评价,并利用基于i TRAQ的定量蛋白质组学对这些胚胎的蛋白质谱进行了比较。研究结果发现,5%氧气水平下的囊胚发育率、孵化率、胚胎质量和细胞计数等显著高于20%氧气条件,5%氧气组的胚胎冷冻解冻的囊胚孵化率也显著提高（p<0.05）。通过比较培养于5%和20%氧气水平下的孵化囊胚的蛋白质组数据,我们鉴定出43个差异表达蛋白（DEPs）。通过对差异蛋白的功能分析,我们发现这些差异蛋白主要与糖酵解、脂肪酸降解、肌醇磷酸代谢和萜烯类主链合成有关。我们的结果表明,在5%生理氧下培养的胚胎具有更大的发育潜力,而这可能是与Warburg效应（有氧糖酵解）相关。此外,我们的蛋白质组数据表明,在低氧培养的胚胎表现出更高的脂质降解、更高的胆固醇水平和更高的不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸比值,这些变化可能与低氧条培养的胚胎具有更高的冷冻结果存活能力有关。最后,我们开展研究解析早期胚胎在发育过程中对氧气的感应和调节机制。为此,我们在胚胎培养的特定阶段,将胚胎在缺氧条件下进行短暂的处理,而后评估其对与胚胎发育的影响。首先,我们对胚胎发育阶段、处理时间和低氧水平进行了优化,然后评估短暂的缺氧处理（HP）对20%或5%氧条件下培养的胚胎发育情况。结果表明,HP处理提升了20%氧培养胚胎的发育潜能。为了解析胚胎对氧感应的机制,我们使用基于i TRAQ的定量蛋白质组学,比较了20%氧培养的晚期桑葚胚,在HP处理（12小时,1%氧气）或不处理的蛋白质谱。结果发现,两者之间存在22个差异表达蛋白（DEPs）。对这些蛋白的功能分析表明,DEPs主要与蛋白质合成、细胞存活和能量代谢有关。我们的研究结果表明,处于致密后期的胚胎对外界氧气浓度变化具有感应和调控能力,而缺氧预处理后的高孵化率可能与糖酵解效应有关。蛋白质组学分析显示,桑椹胚发育后期,其糖酵解、氧化磷酸化和脂质代谢相关蛋白的表达降低,说明为维持能量守恒,降低了代谢活性。本研究有关氧气调控的作用仅针对早期胚胎,有关对胚胎长期影响还需对进一步胚胎发育开展更多的研究来验证。综上所述,本研究使用优化培养体系（OCS）改善了水牛胚胎发育情况,从本研究中的结果也可以看出,生理氧环境为胚胎发育提供了有利的条件,其改善的机制与warburg效应和脂质代谢的改变有关。此外,缺氧预处理可以作为常氧培养体系中促进胚胎发育的有效方法。这些数据为后续的相关实验提供了良好的参考。