论文部分内容阅读
目的：肝病是一类较常见的严重影响人类健康的疾病，若肝损伤长期得不到及时有效的治疗，最终会进展为肝癌或肝衰竭，显著降低病人生存质量并直接威胁生命。虽然不同的肝病发生机制各不相同，但有研究表明免疫系统在大多数发病过程中起着关键作用。伴刀豆蛋白A(Con A)诱导的急性肝损伤模型是一个较理想的T细胞介导的肝炎小鼠模型，用来模拟人病毒性和自身免疫性肝病。36个氨基酸多肽片段是本室前期在寻找早期肝炎临床诊断的生物标志物时运用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）从慢性肝炎病人血清中检测到的一个含量较高的多肽。经初步研究发现该多肽高表达可改变体外培养的HepG2细胞的增殖周期，促进细胞进入S期。迄今为止，还没有关于该多肽在肝炎动物模型中生理和病理作用的研究，我们推测其可能在肝炎的进展过程中发挥作用，故进行本研究。本研究利用ConA诱导小鼠急性肝损伤模型研究该36个氨基酸多肽片段在免疫诱导的肝损伤中的作用，并初步探讨其作用机制，为下一步临床肝病治疗提供实验依据。方法：1预防性给予小鼠人工合成的36个氨基酸多肽片段或地塞米松，一小时后注射Con A诱导肝损伤。Con A注射12小时后检测各组血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平，肝组织进行石蜡包埋并作HE染色，观察该多肽预防性给药对ConA诱导肝损伤的影响。2预防性给予小鼠人工合成的36个氨基酸多肽片段或地塞米松，一小时后给予致死剂量Con A，观察各组小鼠72小时内的死亡情况，进行生存分析，进一步确定该多肽片段对ConA诱导肝损伤的保护性作用。3流式细胞术（FCM）检测各组小鼠肝细胞凋亡及有丝分裂情况，从肝细胞角度探讨该多肽片段在ConA诱导肝损伤过程中的作用机制。4FCM检测各组小鼠肝组织淋巴细胞（T细胞、NK细胞和NKT细胞）浸润情况，探讨该多肽片段在ConA诱导肝损伤免疫应答方面的作用机制。5通过尾静脉注射Con A诱导肝损伤，0.5小时后给予36个氨基酸多肽片段进行治疗，检测Con A注射后12小时后各组血清ALT和AST水平，肝组织进行石蜡包埋并作HE染色，观察其对ConA诱导肝炎的治疗作用。此外，用致死剂量ConA处理小鼠后，用多肽片段或地塞米松治疗，观察其72小时内的死亡情况，做生存分析，进一步确定该多肽片段对ConA所致肝损伤的治疗效果。结果：136个氨基酸多肽片段预防性给药对Con A诱导的肝损伤的影响与模型组相比，各多肽片段及地塞米松预防性给药组均显著降低血清ALT和AST水平(均P<0.05)。HE染色结果显示模型组小鼠肝组织出现典型肝坏死表现及淋巴细胞浸润；多肽片段75μg/kg组肝细胞坏死明显减少，其他剂量组（150μg/kg、300μg/kg和600μg/kg）以及地塞米松组均未见肝细胞坏死区域。236个氨基酸多肽片段预防性给药对致死剂量Con A导致的小鼠生存情况的影响多肽片段和地塞米松预防性给药组小鼠生存率分别为70%和80%，中位生存时间均为72小时，均显著高于模型组（20%，11小时），可见多肽片段能有效降低小鼠的死亡率(均P=0.004)。336个氨基酸多肽片段预防性给药对肝细胞周期和凋亡的影响各多肽片段及地塞米松预防性给药组小鼠凋亡肝细胞所占比例分别为14.73±3.37%，10.01±0.78%，6.41±0.98%，12.86±1.79%，8.4±2.01%，均显著低于Con A模型组30.24±1.29%，P值均小于0.01；随着多肽片段剂量增大凋亡细胞所占比例呈现下降趋势，当多肽片段达到600μg/kg时凋亡细胞所占比例出现上升。多肽片段600μg/kg组G0/G1期肝细胞所占比例显著高于模型组，G2/M期和S期肝细胞所占比例显著低于模型组(均P<0.01)；多肽片段75μg/kg、150μg/kg和300μg/kg组G2/M肝细胞所占比例均低于模型组(均P<0.05)；地塞米松组G0/G1期肝细胞所占比例显著高于模型组，G2/M期和S期肝细胞所占比例显著低于模型组(均P<0.01)。436个氨基酸多肽片段预防性给药对肝组织淋巴细胞浸润数量的影响各多肽片段预防性给药组小鼠肝组织浸润T细胞、NK细胞及NKT细胞比例与模型组相比无明显差异，地塞米松组T细胞和NKT细胞比例显著低于模型组(均P<0.01)。536个氨基酸多肽片段对Con A所引起的肝损伤的治疗作用多肽片段治疗组和地塞米松治疗组血清ALT和AST水平均显著低于模型组(均P<0.01)，HE染色均未见明显肝细胞坏死区域。对致死剂量ConA诱导的肝损伤，多肽片段治疗后小鼠生存率和中位生存时间分别为50%和58小时，地塞米松治疗后小鼠生存率和中位生存时间分别为60%和72小时，两组的生存率和中位生存时间均显著高于模型组（20%，13小时，P<0.026，P<0.011），说明治疗性给药也可提高小鼠生存率和中位生存时间。结论：1外源性给予36个氨基酸多肽片段可有效预防和治疗Con A诱导的肝炎。2外源性给予36个氨基酸多肽片段减轻Con A所引起肝损伤的机制可能与抑制肝细胞凋亡及影响细胞有丝分裂有关。