一、研究目的及意义恶性黑色素瘤恶性程度极高、发病隐匿、易发生血行转移、预后差、死亡率高,临床治疗很棘手。随着分子生物学的发展,恶性黑色素瘤的基因治疗尤其是自杀基因治疗为患者带来了希望,成为继传统的手术切除、放疗、化疗等方法后的一种新的抗肿瘤治疗措施。由于目前载体转染效率较低、靶向性不够等问题没解决,所以单纯自杀基因治疗,仍有部分肿瘤细胞残余导致肿瘤复发,这是该疗法存在的重大缺陷。旁观者效应即转染基因的阳性细胞对未转染基因的阴性细胞的杀伤效应是自杀基因治疗的显著特点,如何提高自杀基因的旁杀伤效应成为研究的重点。前期研究已经证实：体外姜黄素和白藜芦醇对自杀基因系统治疗肿瘤均具有明显的增效作用,其增效作用缝隙连接机制相关。本研究在此基础之上,进一步通过体内体外实验验证其联合自杀基因系统对治疗肿瘤的增效作用。本研究将自杀基因HSV1-tk/GCV系统与中药活性成分姜黄素和白藜芦醇在体外实验中联合,以小鼠恶性黑色素瘤B16细胞为对象进行了杀伤实验研究和缝隙连接机制的探讨；将自杀基因HSV1-tk/GCV系统与姜黄素和白藜芦醇在体内实验中联合,以小鼠恶性黑色素瘤移植瘤为对象进行药物杀伤实验研究。通过研究以期为中医药联合自杀基因疗法提供实验数据和科学依据。二、研究方法：1.姜黄素或白藜芦醇对B16细胞生长的影响：姜黄素设0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM组,白藜芦醇设0μM、25μM、50μM、100μM、200μM组,MTT法检测各浓度的姜黄素和白藜芦醇对B16细胞生长的影响。2.tk+细胞比例的确定：体外实验设置对照组、0%tk/B16、10%tk/B16、20%tk/B16、40%tk/B16、80%tk/B16、100%tk/B16组,MTT检测杀伤效率。体内实验SPF级C57BL／6J小鼠60只,雄性,设置正常组、模型组、0%tk／B16组、20%tk／B16组、40%tk／B16组、80%tk／B16组,正常组于右前肢腋下注射0.1ml／只生理盐水,其他各组于右前肢腋下接种2×106个／ml,0.1ml／只,正常组第8-14天腹腔注射生理盐水0.2ml·只-1·d-1,模型组、其他各组组于第8-14天腹腔注射10g／L的GCV0.2ml·只-1·d-1。出现肿瘤后用游标卡尺每天测肿瘤的长径A和短径B,并计算其体积。第15天处死老鼠取肿瘤,称其重量,并拍下肿瘤照片。3.姜黄素或白藜芦醇对tk/GCV系统杀伤B16细胞增效作用的量效关系：按B16／tk占总细胞数的20%比例混合B16与B16／tk细胞,姜黄素设置0gM、5μM、10gM、20μM、0μM联合GCV组,5μM联合GCV组,10μM联合GCV组、20μM联合GCV组,白藜芦醇设置0μM、12.5μM、25μM、50μM、0μM+GCV组、12.5gM联合GCV组、25μM联合GCV组、50μM联合GCV组,MTT法检测各组细胞的抑制率,用金正钧Q值分析姜黄素或白藜芦醇与自杀基因治疗系统联合作用对旁观者效应是否具有协同性。4.姜黄素和白藜芦醇分别对小鼠恶性黑色素瘤细胞GJIC功能的影响：设对照组、5μM姜黄素组、10μM姜黄素组、20μM姜黄素组,细胞接种荧光示踪法测定姜黄素对B16细胞GJ功能的影响；设对照组、12.5 u M白藜芦醇组、25μM白藜芦醇组、50μM白藜芦醇组,细胞接种荧光示踪法测定白藜芦醇对B16细胞GJ功能的影响。5.姜黄素或白藜芦醇对小鼠黑色素瘤移植瘤自杀基因疗法的增效作用：SPF级C57BL／6J小鼠170只,雌雄各半。设置正常组、模型组、GCV治疗组、姜黄素(100mg/kg)治疗组、姜黄素(100mg/kg)联合GCV治疗组、白藜芦醇1(100mg/kg)治疗组、白藜芦醇1(100mg/kg)联合GCV治疗组、白藜芦醇2(200mg/kg)治疗组、白藜芦醇2(200mg/kg)联合GCV治疗组,正常组于右前肢腋下注射0.1ml／只生理盐水,其他各组于右前肢腋下接种2×106个／ml,0.1ml／只,正常组第2-14天腹腔注射生理盐水0.2ml·只-1·d-1,模型组、GCV组于第2天开始腹腔注射生理盐水0.2ml·只-1·d-1,姜黄素(100mg/kg)组和姜黄素(100mg/kg)联合GCV组第2天开始注射20g／L的姜黄素溶液0.2ml·只-1·d-1,白藜芦醇(100mg/kg)组和白藜芦醇(100mg/kg)联合GCV组第2天开始注射20g／L的白藜芦醇溶液0.2ml·只-1·d-1,白藜芦醇(200mg/kg)组和白藜芦醇(200mg/kg)联合GCV组第2天开始注射40g／L的白藜芦醇溶液0.2ml·只-1·d-1,第8天开始GCV组注射10g／L的GCV0.2ml·只-1·d-1,姜黄素(100mg/kg)联合GCV组注射40g／L姜黄素溶液0.1ml·只-1·d-1和20g／L的GCV0.1ml·只-1·d-1,白藜芦醇(100mg/kg)联合GCV组注射40g／L白藜芦醇溶液0.1ml·只-1·d-1和20g／L的GCV0.1ml·只-1·d-1,白藜芦醇(200mg/kg)联合GCV组注射80g／L白藜芦醇溶液0.1ml·只-1·d-1和20g／L的GCVO. 1ml·只-1·d-1。出现肿瘤后用游标卡尺每天测肿瘤的长径A和短径B,并计算其体积。第15天处死老鼠取肿瘤,称其重量,并拍下肿瘤照片。三、研究结果1.姜黄素或白藜芦醇对B16细胞生长的影响：MTT结果显示：姜黄素5μM、10μM、20μM、40μM、80μM组对B16细胞的抑制率分别为10.82%、18.92%、41.24%、65.74%、89.08%；与空白对照组比较5μM、10μM、20μM、μM、40μM、80μM组对B16细胞有抑制作用(p<0.01)。白藜芦醇25μM、50μM、100μM、200μM组对B16细胞的抑制率分别为27.22%、46.97%、48.10%、62.63%。与空白对照组比较25μM、50μM、100μM、200μM组对B16细胞有抑制作用(p<0.01)。2.tk+细胞比例的确定：体外实验MTT结果显示0%tk／B16组、10%tk／B16组、20%tk／B16组、40%tk／B16组、80%tk／B16组、100%tk／B16组的抑制率分别为11.27%27.40%35.73%57.51%71.21%,体内实验显示随着tk／B16比例的增加抑瘤效应也增加,80% tk／B16与其他各组比较均有统计学意义(p<0.01)。为了给中药发挥药效留下空间并模拟临床转染效率低,故采用20%tk／B16混合。3.姜黄素或白藜芦醇对tk／GCV系统杀伤B16细胞增效作用的量效关系：姜黄素5μM、10μM、20μM联合20%tk/GCV组的实际抑制率(38.84%、43.13%、54.31%)显著高于理论抑制率(21.04%、30.20%、46.70%),金正钧Q值分别为1.85、1.43、1.16,均大于1.15,具有增效协同作用；白藜芦醇12.5μM、25μM、50μM联合20%tk/GCV组的实际抑制率(30.11%、45.89%、55.72%)显著高于理论抑制率(12.99%、38.71%、39.79%),金正钧Q值分别为2.31、1.19、1.40,均大于1.15,也具有增效协同作用。4.姜黄素和白藜芦醇对小鼠恶性黑色素瘤细胞自杀基因疗法GJIC功能的影响：姜黄素和白藜芦醇均能促进B16细胞的GJ功能,且呈量效依赖关系；5.姜黄素和白藜芦醇对小鼠黑色素瘤移植瘤自杀基因疗法的增效作用：各治疗组与模型组比较肿瘤生长呈抑制状态(p<0.05)。GCV治疗组、姜黄素组、姜黄素联合GCV组、白藜芦醇1组、白藜芦醇1联合GCV组、白藜芦醇2组、白藜芦醇2联合GCV治疗组的抑瘤率分别为38.88%、35.14%、60.99%、45.81%、60.14%、54.94%、70.92%；治疗结束后肿瘤质量各治疗组与模型组比较均减小(p<0.05),其中姜黄素联合GCV组、白藜芦醇1联合GCV组、白藜芦醇2组、白藜芦醇2联合GCV组显著减小(p<0.01)；姜黄素组、姜黄素联合GCV组、白藜芦醇1组、白藜芦醇1联合GCV组、白藜芦醇2组、白藜芦醇2联合GCV组与GCV组比较,白藜芦醇1联合GVC治疗组肿瘤质量减轻(p<0.05),姜黄素联合GCV组和白藜芦醇2联合GCV组肿瘤质量显著减小(p<0.01)。其他各组两两间比较差异无统计学意义。四、结论本研究体外实验发现了姜黄素和白藜芦醇对B16细胞有生长抑制作用,并且姜黄素和白藜芦醇对B16细胞株tk／GCV系统具有增效作用,其增效作用与缝隙连接有关。体内试验发现姜黄素和白藜芦醇对小鼠恶性黑色素瘤移植瘤的自杀基因治疗同样具有增效作用。