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第一部分EGFL7表达与肝癌临床病理特征及侵袭转移的相关性分析目的:研究EGFL7与肝癌患者临床病理特征、侵袭转移、生存预后的相关性。方法:收集110例肝癌患者的血清标本,采用ELISA的方法检测血清EGFL7蛋白水平,结合患者性别、年龄、乙肝病史、Child-Pugh评分、病灶数目、病灶直径、血管侵犯、肝外转移信息,研究EGFL7与肝癌临床病理特征的相关性。采用免疫组化的方法,分析组织芯片中90例肝癌标本的EGFL7表达,结合患者转移时间、生存期,研究EGFL7与肝癌侵袭转移及预后的相关性。结果:肝癌患者血清EGFL7蛋白(pg/ml):男性21.7±13.7,女性23.6±12.8,差异无显著性(P>0.05);年龄<60岁23.5±14.2,>60岁20.5±12.9,差异无显著性(P>0.05);Child-Pugh评分 A 级 20.8±13.9,B 级 27.3±9.9,C 级 27.9±13.9,差异有显著性(P<0.05);病灶数目≤3个22.0±13.7,>3个22.4±13.4,差异无显著性(P>0.05);病灶直径≤5cm 21.8±12.9,>5\≤10cm21.6±14.5,>10cm22.6±13.8,差异无显著性(P>0.05);有血管侵犯32.0±11.8,无18.8±12.5,差异有显著性(P<0.05);有肝外转移31.7±12.4,无18.4±12.2,差异有显著性(P<0.05)。90例肝癌标本中,EGFL7高表达70例,低表达20例。高表达组的中位生存时间为27月,低表达组的中位生存时间为69月,两组生存差异有显著意义(P<0.05)(图1-12)。高表达组的中位无瘤生存时间为33月,低表达组的中位无瘤生存时间为79月,两组差异有显著意义(P<0.05)。结论:肝癌临床病理特征中血管侵犯、肝外转移、肝功能分级与血清EGFL7水平密切相关。出现血管侵犯或肝外转移,肝功能分级高的患者血清EGFL7蛋白水平升高。病灶组织中EGFL7高表达的患者,更容易发生转移,生存期更短。EGFL7与肝癌侵袭转移和不良预后密切相关。第二部分缺氧对EGFL7蛋白水平影响的临床研究目的:在临床表象水平,研究缺氧对肝癌患者EGFL7蛋白水平的影响。方法:用免疫组化的方法对50例肝癌标本进行HIF-lα染色。根据切片中阳性细胞百分率将患者分为3组:阳性细胞百分率<10%为HIF-lα阴性组;阳性细胞百分率10%～50%为HIF-1α阳性组;阳性细胞百分率>50%为HIF-lα强阳性组。同时采用ELISA法检测患者外周血EGFL7蛋白。采用Mαnn-Whitey法对3组患者EGFL7蛋白的差异进行统计分析。结果:50例患者中,HIF-lα阴性15例、HIF-1a阳性24例、HIF-1α强阳性11例。HIFlα阴性组血清EGFL7蛋白平均数为15.1 pg/ml,HIFlα阳性组为31.7 pg/ml,HIFlα强阳性组为31.6 pg/ml。强阳性组与阴性组、阳性组与阴性组之间的差异有统计学意义(p<0.05),而阳性组与强阳性组之间的差异无统计学意义(p>0.05)。结论:在肝细胞癌中,肿瘤组织缺氧状态下,外周血EGFL7蛋白水平较不缺氧状态显著升高。缺氧是刺激肝癌EGFL7上调的信号之一。第三部分缺氧对EGFL7蛋白水平影响的细胞学研究目的:在细胞水平,研究缺氧对肝癌细胞EGFL7蛋白水平的影响。方法:用 Western blot 和 Real-time PCR 方法检测 Hep3b、SMMC-7721、SMMC-7701、97L、97H肝癌细胞株EGFL7蛋白的表达,选取EGFL7表达水平最高和最低的肝癌细胞株进行后续的实验。用三气培养箱模拟缺氧环境,分别培养两株肝癌细胞,缺氧环境的氧浓度设为1%。分别于常氧培养,及缺氧培养1、2、4、8小时用Western blot和Real-time PCR方法检测肝癌细胞的EGFL7蛋白和mRNA。采用单因素方差分析比较差异的显著性。结果:在 Hep3b、SMMC-7721、SMMC-7701、97L、97H 肝癌细胞株中,EGFL7表达最高的是SMMC-7721细胞株,EGFL7表达最低的是97H细胞株。常氧,及缺氧培养SMMC-7721细胞1、2、4、8小时,Western blot检测EGFL7蛋白的平均灰度值依次为 0.140±0.01、0.335±0.02、0.429±0.04、0.656±0.05、0.701±0.04,差异有显著性(P<0.001),Real-time PCR 检测的 EGFL7mRNA 相对量依次为 1.019±0.248、0.677±0.090、0.719±0.264、0.870±0.119、0.724±0.058,差异无显著性(P>0.05)。在97H细胞中得到相似结果。常氧,及缺氧培养97H细胞1、2、4、8小时,Western blot检测 EGFL7 蛋白的平均灰度值依次为 0.231±0.01、0.324±0.02、0.549±0.04、0.668±0.05、0.903±0.04,差异有显著性(P<0.001),Real-time PCR 检测的 EGFL7mRNA 相对量依次为 1.010±0.176、1.074±0.092、0.988±0.134、0.885±0.018、1.022±0.105,差异无显著性(P>0.05)。结论:缺氧培养的肝癌细胞,EGFL7蛋白较常氧状态下升高,并且呈时间依赖性,缺氧培养时间越长EGFL7蛋白水平越高。但缺氧状态下EGFL7mRNA与常氧状态下无差异。缺氧可以上调EGFL7蛋白水平,但这种上调作用并不发生在转录水平。