尽管人类在恶性疟原虫疫苗的开发上做出了很大努力，但效果并不明显．早期的疫苗开发主要集中于疟原虫血液感染阶段，当前科学家提取了一种新的策略-传播阻断疫苗(transmissionblockingvaccinesTBVs)．TBVs针对是疟原虫的有性期宿主按蚊中表达的靶抗原及与疟原虫发育相关的蚊中肠蛋白，能够干扰疟原虫在蚊体内的发育，阻断传播使其失去感染能力．对蚊中肠表面糖蛋白的进一步研究和基因鉴定有助于阐明动合子黏附与侵入蚊中肠上皮细胞的可能机制。 在本项研究中，我们获得了一株稳定分泌按蚊中肠可溶性抗原的杂交瘤细胞株 实验方法 1．嗜人按蚊 蚊虫饲养于室内，温度保持26~C，相对湿度在80％以上，每天光照12h～16h。平时以10％葡萄糖溶液喂食，雌蚊饲以ICR小鼠血。 2．单克隆抗体的制备 将经嗜人按蚊中肠可溶性抗原免疫的BALB／c小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2／0细胞进行融合，经HAT培养基选择培养，用间接ELISA法进行杂交瘤细胞筛选。抗体阳性细胞经连续3次克隆后，建立稳定分泌抗嗜人按蚊中肠可溶性抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 3．杂交瘤细胞及单克隆抗体的鉴定 杂交瘤细胞株经秋水仙素处理、低渗处理、固定、制片、染色、显微镜观察染色体形态并计数进行染色体分析。采用Sigma抗体亚型检测试剂盒测定单克隆抗体的Ig类别和亚类。细胞连续传代三个月及液氮冻存一个月后复苏，不同时间取其培养液上清，用间接ELISA法检测其抗体效价，测定抗体分泌的稳定性。 采用WesternBlot法将嗜人按蚊中肠抗原、中华按蚊中肠抗原、淡色库蚊中肠抗原、白纹伊蚊中肠抗原分别与所得单克隆抗体进行反应，对单克隆抗体的特异性进行测定。同时采用WesternBlot法分析单克隆抗体所识别的嗜人按蚊中肠可溶性抗原的蛋白组分。 结果 L单克隆抗体的制备 通过对嗜人按蚊可溶性抗原的包被浓度、酶标二抗的使用浓度和封闭条件的选择，建立了杂交瘤细胞的筛选方法，对连续3次克隆的杂交瘤细胞用间接ELISA方法进行筛选，建立了1株3G3稳定分泌抗嗜人按蚊中肠可溶性抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 2．杂交瘤细胞及单克隆抗体的鉴定 经鉴定，杂交瘤细胞的染色体数为102条，所获得的分泌抗体的细胞为杂交瘤细胞。采用Sigma抗体亚型检测试剂盒测定单克隆抗体的Ig类别和亚类为IgGl。细胞连续传代三个月，分泌抗体的能力稳定；液氮冻存一个月后复苏，对细胞上清进行检测，抗体仍为阳性。将杂交瘤细胞腹腔注射小鼠制备腹水，检测杂交瘤细胞上清和腹水的效价，分别为l：3200-1：12800和1：10000-1：20000。 通过与中华按蚊中肠抗原、淡色库蚊中肠抗原、白纹伊蚊中肠抗原的交叉反应对单克隆抗体的特异性进行分析，所获得的l株单克隆抗体为特异性单抗。且均识别中肠可溶性抗原20kDa抗原。 结论 本实验获得了1株稳定分泌特异性、高效价嗜人按蚊中肠可溶性抗原的杂交瘤细胞株；识别嗜人按蚊中肠可溶性抗原20kDa蛋白。