侵袭、转移行为是恶性肿瘤的本质特征,防治肿瘤的侵袭、转移是降低肿瘤病死率的重要途径之一。肿瘤疾病与血栓形成之间的关系早在1865年就有阐述,大部分实体瘤病人体内均发现低度血管内凝血,尤其是有巨大瘤体或肺转移的病人。实验显示,全身的或者局部的血液凝固反应被激活后可以加速肿瘤的转移。凝血系统的多种凝血因子参与了肿瘤的发生发展,凝血酶不仅是凝血过程中的一种重要凝血因子,也是肿瘤发生发展过程中的重要因子。以往研究认为,凝血酶促进肿瘤转移的作用主要是通过其受体--蛋白酶活化受体(protease-activated receptors,PARs)而发挥作用。PARs是一类G蛋白偶联受体,目前共有4个PARs被发现,而PAR1被认为是凝血酶的主要受体。凝血酶与PAR1的作用主要涉及凝血酶的两个功能域,即exosite结构域和催化结构域,其exosite结构域与PAR1上与水蛭素(hirudin,Hir)C末端序列类似的结构域结合,其催化结构域则与PAR1的N末端结合并将其降解,产生新的N末端(其氨基酸序列为N-SFLLRN),该新形成的N末端与受体本身的细胞外区域结合,从而引发受体不可逆的激活,也就是说,凝血酶对PAR1的激活是依赖于其催化结构域的活性。以往的研究主要集中于凝血酶通过表达于血管内皮细胞上的PAR1参与肿瘤血管新生。近年的研究显示,具有转移潜能的肿瘤细胞表面也表达PAR1,凝血酶因此可以促进肿瘤细胞本身的增殖、迁移、黏附等活动。研究表明整合素参与凝血酶的促肿瘤转移作用,但机制尚不清楚。整合素是一种细胞膜受体,其配体如纤粘连蛋白、层粘连蛋白和胶原蛋白等均含有RGD(Arg-Gly-Asp)序列,该序列是与整合素作用的关键结构域。研究表明,凝血酶分子中也含有RGD序列,但该序列在通常情况下被掩埋在凝血酶分子的220-环内部,无法形成有功能的构象,但在高盐环境和被固定化后(包被于细胞培养板上),凝血酶分子构象发生改变,暴露其RGD序列,并发挥相应功能。因而我们推测,凝血酶有可能与整合素发生相互作用,而这种作用有可能通过其它中间分子介导。资料研究分析,PAR1是值得考虑的最重要的分子之一。其方式可能是:凝血酶首先与PAR1结合,结合于PAR1上的凝血酶并不从PAR1上解离,而是通过其exosite位点继续固定于PAR1后上,其催化位点则发生构象的转变,暴露其RGD序列,并通过RGD序列直接激活整合素。支持凝血酶能被PAR1固定后再与其它分子结合的资料见于Andrew JL等的报道,在血小板上,凝血酶通过其exosite与PAR1结合后,其催化结构域还可以再与PAR4结合,从而同时激活PAR1和PAR4。本研究的目的是探讨凝血酶的受体PAR1和整合素在肿瘤转移中的作用及其机制,构建一种含有水蛭素和RGD序列的融合蛋白,通过分别抑制凝血酶与PAR1以及凝血酶与整合素的作用,达到抑制肿瘤转移的作用。方法与结果:①利用PAR1的抗体anti-PAR1、整合素抗体anti-αv、整合素的拮抗剂GRGDS(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser)多肽,通过GLC-82肺癌细胞的迁移和黏附实验,发现PAR1的拮抗剂和整合素αv的拮抗剂均可抑制凝血酶的促肿瘤转移作用,证明PAR1和整合素αv均参与了凝血酶的促肺癌细胞转移作用。②利用免疫共沉淀实验,初步证明PAR1和整合素αv之间存在相互作用。③通过ERK的磷酸化、PAR1和整合素激活后对胞内信号通路的影响,阐明整合素可能通过ERK信号通路来调控细胞的活动。④通过质粒构建、克隆载体的表达、发酵和分离纯化获得目的蛋白RGD-TH。⑤通过细胞增殖、迁移与黏附实验检测RGD-TH在抑制肿瘤转移中的作用。在细胞增殖实验中,我们用0.1U/ml、1U/ml和5U/ml三个浓度的凝血酶刺激GLC-82肺癌细胞,然后用融合蛋白RGD-TH做为抑制剂,我们发现5U/ml的凝血酶能刺激细胞的增殖,相应地RGD-TH也抑制了凝血酶的作用。在黏附实验中RGD-TH抑制了凝血酶的促肺癌细胞粘附作用,但在迁移实验中RGD-TH无明显作用。结论:本研究利用GRGDS多肽、整合素αv的抗体作为拮抗剂,研究凝血酶的促肿瘤转移和黏附作用与整合素的关系中发现,凝血酶的作用可被GRGDS多肽、整合素αv的抗体抑制,说明整合素参与凝血酶的促GLC-82肺癌细胞的转移作用,提示RGD序列在整合素参与凝血酶的促肿瘤转移中可能发挥重要作用。我们通过免疫共沉淀证实了整合素αv与PAR1可以共沉淀,提示凝血酶的促肿瘤细胞转移作用可能由PAR1来介导。整合素和PAR1介导的凝血酶的促肿瘤转移的作用可能经由ERK通路进行。我们构建的融合蛋白RGD-TH,对肿瘤细胞的增殖和黏附具有明显抑制作用,而对肿瘤细胞的迁移无明显作用,这可能是融合蛋白的两组分之间产生彼此功能影响,无法发挥各自的功能。