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目的:研究大鼠全脑缺血再灌注即刻开始的头部浅低温对GLT-1及凋亡表达的影响,来进一步探讨浅低温的脑保护机制,为低温疗法在临床中应用提供参考。方法:健康雄性wistar大鼠258只,通过随机数字法随机分为6组,具体如下:1)对照组(cotrol组,n=6):不做任何手术操作,直接断头取材。2)假手术组(sham组,n=42):只做暴露双侧椎动脉和颈总动脉假手术操作。3)凝闭双侧椎动脉组(VOA组,n=42):凝闭大鼠双侧椎动脉48小时后,暴露两侧颈总动脉穿线,但不阻断血流。4)常温缺血再灌注组(NI/R组,n=42):凝闭大鼠双侧椎动脉48小时后,暴露并夹闭两侧颈总动脉8分钟,然后恢复血流再通,期间保持海马温度及肛温在37±0.5℃。5)低温组缺血再灌注组(HI/R组,n=42):凝闭大鼠双侧椎动脉48小时后,暴露两侧颈总动脉,并穿线备用。采用鼻咽腔降温法待海马温度降至33±0.5℃后夹闭两侧颈总动脉8分钟,然后恢复血流再通,维持头部浅低温(33±0.5℃),肛温维持在37±0.5℃,2小时后自然复温。6)生理盐水+低温缺血再灌注组(NS+HI/R组,n=42):凝闭大鼠双侧椎动脉48小时后,暴露双侧颈总动脉,并穿线备用,缺血前30 min右侧脑室注射生理盐水20μL,采用鼻咽腔降温法待海马温度降至33±0.5℃夹闭双侧颈总动脉,8 min后恢复血流再灌注,维持头部浅低温(33±0.5℃),肛温维持在37±0.5℃,2小时后自然复温。7)DHK+低温缺血再灌注组(DHK+HI/R组,n=42):凝闭大鼠双侧椎动脉48小时后,暴露双侧颈总动脉并穿线,缺血前30 min右侧脑室注射DHK(二经卡因酸盐,为GLT-1功能性拮抗剂)溶液20μL(200 nmol),采用鼻咽腔降温法使海马温度降至33±0.5℃夹闭双侧颈总动脉,8 min后恢复血流再灌注,维持头部浅低温(33±0.5℃),肛温维持在37±0.5℃,2小时后自然负复温。对照组大鼠不做任何处理,直接断头取材。其余各组大鼠于缺血再灌注即刻(0 h)、8 h、16 h、1 d、3 d、5 d、7 d断头取脑,每个时间点取6只,1~5组大鼠取脑后沿正中线纵行切开,左侧脑组织用4%多聚甲醛固定制成5 mm石蜡切片,通过硫堇染色观察海马病理学变化,记录神经元密度(ND)和病理学分级(HG)。通过免疫组化技术观察GLT-1、Bax和Bcl-2蛋白的表达情况。右侧脑组织快速分离海马CA1区,液氮速冻后冻存于-80℃冰箱,通过Western blot技术对GLT-1蛋白的表达水平进行半定量分析。6、7组断头后直接多聚甲醛固定用于硫堇染色,观察病理学变化。结果:1硫堇染色后光镜观察病理结果对照组大鼠海马CAl区的神经元排列整齐有序,ND为214±3.7,HG为0级。假手术组各时间亚组都没有明显神经元损伤,与对照组相比,ND和HG无统计学差异(P>0.05)。NI/R组大鼠7 d时海马CA1区神经元几乎全部死亡,HG明显升高,为Ⅲ级,ND(42±3.4)明显降低。HI/R组在7d只有散在神经元损伤,HG为0~Ⅰ级,低于NI/R组7d亚组(P<0.05);ND(187±3.0)显著高于NI/R组7d亚组(P<0.05)。NS+HI/R组在7d时,海马CA1区未见明显神经元损伤,HG 0~Ⅰ级,ND为175±2.1。而DHK+HI/R组,7d时CA1区可见大量神经元死亡,HG分级为Ⅱ~Ⅲ级,ND为63±2.6,与NS+HI/R组比较,有统计学差异(P<0.05)。2海马组织GLT-1蛋白表达水平的比较。2.1 Western blot分析对照组GLT-1表达较少。假手术组与对照组比差异不显著(P>0.05)。在VOA组大鼠中,在缺血即刻开始大量表达,8h时达峰,16h减少,1d最少,5d再次增多,各时间亚组明显高于假手术组(P<0.05)。NI/R组0h时明显增多并迅速达峰值,8h减少,5d时下降最为显著,7d基本达到缺血前水平,除1d外各时间亚组均低于VOA组(P<0.05)。HI/R在0h开始表达,8h达峰,16h减少,5d最少,但仍有较高水平表达,在各时间亚组均高于NI/R组(P<0.05)。2.2 GLT-1免疫组化GLT-1阳性免疫颗粒主要表达于海马CA1区星形胶质细胞中,呈棕黄色。假手术组和对照组各时间均有少量GLT-1表达。VOA组在0h大量表达,8h达峰,16h减少,3d时再次增多,然后减少,各时间点均明显高于假手术组(P<0.05)。NI/R组在0h开始增多,8h达峰,16h~7d时明显减少,每个时间点均低于VOA组(P<0.05)。在HI/R组除0h以外,其他各时间均高于NI/R组(P<0.05)。3海马组织Bax、Bcl-2蛋白表达水平比较。3.1 Bax免疫组化Bax阳性区域呈棕黄色颗粒状沉积,主要分布于神经元细胞胞浆和突触的起始部。在对照组和假手术组,每个时间亚组Bax表达极少。VOA组0h开始少量表达,16h达峰,然后降低,各时间亚组均略高于VOA组(P<0.05)。NI/R组0h就开始大量表达,3d达峰,5d和7d时大量减少,与VOA比较,除5d,7d外,其余各个时间亚组均增高(P<0.05)。HI/R组0h开始有少量表达,16h达峰,各时间亚组均显著低于NI/R组(P<0.05)。3.2 Bcl-2免疫组化Bcl-2阳性区域呈棕黄色颗粒状沉积,主要分布于神经元胞浆和突触。对照组和假手术组各个时间亚组Bcl-2表达很少,两组比较无统计学差异(P>0.05)。VOA组在0h开始表达,至1~3d达峰,随后减少。NI/R组在0h开始表达,1d达峰,在3d时明显减少,7d天基本降至缺血前水平;HI/R组在0h开始表达,8h达峰,然后轻微下调,7d仍有较高水平表达,每个时间均明显高于NI/R组(P<0.05)。结论:1头部浅低温能够减少缺血再灌注后海马CA1区神经元死亡数量,对脑缺血再灌注损伤有保护作用。2头部浅低温对脑缺血再灌注损伤介导的GLT-1表达下调有抑制作用。3GLT-1可能参与了浅低温的脑保护作用。