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第一部分 体外受精出生小鼠心肌组织肾素-血管紧张素系统表达的变化目的:评估体外受精(IVF)出生小鼠从幼年到老年的心肌组织肾素-血管紧张素系统(RAS)各基因及其心血管效应基因表达变化。材料及方法:1.利用C57BL/6J小鼠建立IVF及体内受精小鼠(in vivo)模型。出生小鼠饲养至3周,10周及1.5年时,分别给予安乐死获取两组小鼠的心脏组织。2.TRIZOL法抽提小鼠心肌组织中的总RNA,逆转录成cDNA后,通过荧光定量PCR技术,测定两组中RAS系统基因Ren1,Ren2,Ace,Ace2,Agt,Agtr1a,Agtr1b,Agtr2,及其心血管效应基因Col1a1,Col1a2,Col3 and Ctgf的mRNA相对表达量。3.用含蛋白酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液提取心肌组织的蛋白质,采用BCA法进行蛋白浓度测定,Western blot技术检测AGTR1,AGTR2,CTGF and COL3蛋白质的相对表达量。结果:1.在3周龄时,IVF组的Ren1,Ace,Agtr1a,Col3和Ctgf的mRNA表达水平显著高于体内组。同样,在10周龄时,IVF组中的Ace,Agt,Agtrlb,Agtr2,Col1al和Col3的mRNA表达水平也明显高于体内组。当达到1.5岁时,IVF组Ren1,Ace,Agtr1b,Col3和Ctgf的mRNA表达水平仍然高于体内组。2.在3周龄时,IVF组AGTR1和CTGF的蛋白表达水平与体内组相比显著增加。10周龄时两组中AGTR1,AGTR2和CTGF蛋白表达水平差异无统计学意义。在老年时,IVF组AGTR1蛋白表达明显上调,但其余蛋白表达水平无显著差异。结论:IVF出生小鼠幼崽期,心肌组织中RAS系统部分基因及其心血管发育和功能调节相关效应基因的表达水平升高,且这种改变可以持续存在,直到老年阶段,提示ART过程可影响出生小鼠心肌组织RAS系统基因表达,并可能是IVF后代心血管畸形或功能障碍的潜在危险因素之一。第二部分 体外受精出生小鼠心肌组织肾素-血管紧张素系统表达改变机制研究目的:研究IVF出生小鼠心肌组织中RAS改变的调控机制,阐明IVF作用因素可能影响子代成年后心血管的关键作用环节,探究基因相互作用机制,为降低IVF出生子代的心血管疾病风险研究提供思路和途径。材料及方法:1.使用DNeasy血液和组织试剂盒提取两组小鼠心肌组织中的基因组DNA。对基因组DNA进行亚硫酸盐修饰,并使用靶向捕获测序技术,检测Col1l1,Ctgf以及印记基因的启动子区域CpG岛的甲基化情况。2.提取小鼠心肌组织中的总RNA,逆转录后,通过miRNA芯片检测老年时期两组小鼠中的miRNA表达谱。3.在芯片筛出的差异miRNA中,聚焦在miRNA数据库预测后分别与Col3a1,Agtr1a和Col1a2相互作用的miRNA:miR-100,miR-297和miR-758作为检测目标。通过定量PCR技术,验证miR-100,miR-297,and miR-758在两组中的表达情况。4.通过构建分别带有AGTR1 3’-UTR或AGTR1 3’-UTR突变片段并将其插入pmiR-RB-Report的荧光素酶报告基因载体,分别转染miR-297a-3pmimic或阴性对照(NC)到293T细胞,检测AGTR1与miR-297的相互作用情况。5.培养H9c2心肌细胞,转染microRNA mimic,在心肌细胞中过表达miR-297。6.细胞转染后48小时,用含蛋白酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液提取心肌细胞中的蛋白质,采用BCA法进行蛋白浓度测定,Western blot技术检测AGTR1,CTGF和COL3蛋白质的相对表达量。7.细胞转染后48小时,向培养物中加入5-乙炔基-20-脱氧尿苷(EdU)(10μM),并使细胞再生长2小时。分别使用流式细胞术和共聚焦显微镜观察H9c2心肌细胞的增殖情况。结果:1.与体内组相比,IVF组3周时Ctgf的平均DNA甲基化水平显著下降。10周时Ctgf的CpG位点18和Ctgf在老年时期的CpG位点2和14的甲基化水平在IVF组中显著降低。2.在3周龄时,Col1a1的CpG位点4的甲基化水平在IVF组中显著降低。Col1a1在10周时的CpG位点6和8以及Col1a1在老年时期的CpG位点1,2和3的甲基化水平在IVF组中显著降低。3.在3周龄时,两组之间未发现miR-100,miR-297和miR-758的表达水平显著改变。而在第10周,miR-100和在IVF组中观察到miR-758与体内组相比显著升高。在老年时期也有类似的趋势,发现IVF组miR-100,miR-297和miR-758的表达水平显著增加。4.miR-297a-3p模拟物显著调节pmiR-AGTR1-WT载体的萤光素酶活性。然而,pmiR-AGTR1-Mut载体的荧光素酶活性不受miR-297a-3p模拟物的影响。这些结果表明miR-297a-3p直接靶向AGTR1并调节其表达。5.miR-297过表达48 h,后AGTR1和CTGF蛋白表达明显增加,表明miR-297可与AGTR1相互作用,进一步促进CTGF蛋白的表达。6.与对照组相比,miR-297过表达能够显著促进心肌细胞增殖。7.IVF组的Igf2r在1.5年时的平均DNA甲基化水平显著降低;IVF组的Mest在10周时的平均DNA甲基化水平有明显升高;IVF组的Snrpn在3周龄时的平均DNA甲基化水平显著降低。结论:1.IVF出生小鼠心肌细胞Ctgf和Col1a1基因表达水平升高可能是由于其Ctgf和Col1a1基因启动子区CpG位点甲基化水平降低所致。2.miR-100,miR-297和miR-758可能参与了 IVF出生小鼠心肌细胞COL3,AGTR1和COL1表达的调控,且miR-297表达水平改变可能调节心肌细胞增殖活性。3.IVF可能通过改变表观遗传学的调控,导致的IVF出生小鼠RAS表达改变,该机制可能是IVF后代心血管畸形或功能障碍的潜在危险因素。