论文部分内容阅读
目的急性肝坏死(acute liver failure, ALF)时继发的感染主要由肠道细菌易位所致,而肠道免疫屏障遭到破坏是发生肠道细菌易位的重要原因。分泌成分(secretory component, SC)是多聚免疫球蛋白受体(polymeric Ig receptor, pIgR)的胞外段部分,主要负责pIgA的转运和SIgA的形成,在维护肠粘膜免疫稳态中具有重要作用。目前研究发现,ALF时肠道pIgR／SC表达减少,从而可导致SIgA分泌合成的减少,使其不能正常地在粘膜表面形成完整的SIgA屏障层,而导致肠源性感染的发生甘草酸苷(glycyrrhizin),是甘草类制剂的典型代表药物,具有抗炎、抗氧化、抗过敏及类固醇激素样作用,被广泛用于治疗肝病及皮肤病等领域,是否glycyrrhizin能影响肝坏死时肠SC的表达尚未见报道。本研究通过肝坏死模型观察glycyrrhizin预先保护组小鼠肠道SC表达变化探索glycyrrhizin在预防急性肝坏死小鼠肠道SC表达减少中的作用,通过观察人结肠上皮细胞系Caco-2在glycyrrhizin或在联合糖皮质激素受体抑制剂(RU486)的作用下,细胞内SC蛋白和SC mRNA的表达情况以及glycyrrhizin对SC启动子活性,SC启动子结合转录因子-上游刺激因子(USF)的影响,探讨glycyrrhizin影响SC表达的作用机制,为研究预防及治疗肝坏死时肠粘膜免疫功能失调提供新的途径和理论依据。材料与方法一、材料1、动物：雄性Balb/c小鼠,6-8周,体重18-25克。2、细胞：Caco-2细胞。3、试剂：GalN; LPS (Ecoli O127:B8); Glycyrrhizin;山羊抗小鼠pIgR/SC抗体；小鼠抗小鼠β-actin单克隆抗体；辣根过氧化物酶标记兔抗山羊二抗；辣根过氧化物酶标记兔抗小鼠二抗；兔抗山羊SP试剂盒；BCA蛋白浓度测定液；SYBR RPrimeScriptTM RT-PCR Kit试剂盒；DEX；山羊抗人pIgR/SC抗体；兔抗人β-actin多克隆抗体；兔抗人USF1多克隆抗体；兔抗人USF2多克隆抗体；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗；辣根过氧化物酶标记兔抗山羊二抗；FITC标记兔抗山羊二抗；胎牛血清；DMSO; RU486。二、方法1、动物分组：实验动物为雄性Balb/c小鼠,随机分为5组。1组：生理盐水(NS)对照组60只；2组：脂多糖(LPS)对照组60只；3组：D氨基半乳糖(GalN)对照组60只；4组：急性肝坏死(ALF)模型组60只；5组：Glycyrrhizin预保护组(LPS/GalN/glycyrrhizin) 60只。2、细胞培养及分组：参照Liu等的方法进行细胞培养。①观察浓度影响：取6组非同代生长达融合的细胞,分别添加0μg/mL,4μg/mL,20μg/mL, 100μg/mL 500μg/mL,1000μg/mL glycyrrhizin培养24h,提取总蛋白和总RNA-130℃保存；②观察时间影响：取5组非同代生长达融合的细胞,以100μg/mL glycyrrhizin分别处理0h、4h、8h、16h、24h,收集Caco-2细胞爬片甲醛固定及提取总蛋白和总RNA-130℃保存；③取6组非同代生长达融合的细胞,添加RU486 (50nM)联合20μg/mL glycyrrhizin或100nM DEX共培养24h,收集Caco-2细胞提取总蛋白和总RNA-130℃保存。3、应用HE染色观察肝脏病理改变和电镜观察肠组织病理变化。4、应用免疫组化染色、western blot和real-time PCR方法观察glycyrrhizin对急性肝坏死小鼠肠道SC表达下降的影响。5、应用免疫荧光染色、western blot和real-time PCR方法检测glycyrrhizin对Caco-2细胞SC蛋白及mRNA表达的影响。6、应用western blot和real-time PCR方法研究糖皮质激素受体抑制剂(RU486)对glycyrrhizin上调肠上皮细胞SC表达的影响。7、将重组质粒PGL2-SC promoter转染Caco-2细胞,通过检测萤火虫荧光素酶报告基因的表达活性,说明glycyrrhizin对SC基因启动子活性的影响。8、应用western blot和real-time PCR方法研究上游刺激因子(USF)及其mRNA表达,说明glycyrrhizin是否通过影响USF表达影响SC基因启动子活性。实验结果1、肝脏HE染色观察：NS组肝细胞完整,肝血窦清晰；ALF模型组可见呈片的出血性坏死,坏死区可见大量炎细胞,残存的肝细胞肿胀；glycyrrhizin预保护组肝脏出血坏死明显减轻,炎性细胞浸润明显减少。2、肠组织电镜观察：NS组肠上皮细胞膜完整,微绒毛排列整齐,线粒体结构正常；ALF模型组可见肠上皮细胞结构破坏,微绒毛稀疏、断裂、脱落,细胞膜结构不完整,线粒体空泡变形,嵴破坏消失；glycyrrhizin预保护组肠上皮微绒毛仅有少量脱落,线粒体空泡变形明显减轻,细胞膜结构较完整。3、肠组织pIgR/SC免疫组化染色：PIgR/SC表达主要定位于肠上皮细胞胞浆和胞膜上。PIgR/SC染色可见NS组呈棕黄色强阳性；ALF模型组小鼠肠组织上皮细胞浆和膜棕黄色阳性染色明显减弱,甚至难见；glycyrrhizin预先保护组肠组织肠上皮细胞浆和膜上呈棕黄色阳性。4、肠组织SC蛋白表达western blot半定量分析：ALF模型组SC表达较对照组明显降低(P＜0.05), glycyrrhizin预先保护组能有效预防急性肝坏小鼠SC表达减少,与ALF模型组相比有统计学差异(P<0.05),与正常对照组相比无统计学差异(P>0.05)5、肠组织SC mRNA相对含量real-time PCR方法检测：ALF组中,SC mRNA的表达量明显减少,与NS组有显著差异(P<0.01)；glycyrrhizin预先保护组SC mRNA含量明显升高,与ALF组有显著差异(P<0.01)与NS组比较亦有显著差异(P<0.01)6、各组细胞plgR/SC免疫荧光染色：PIgR/SC主要分布于细胞膜和细胞浆上,在细胞的外周膜分布较为集中。glycyrrhizin处理后pIgR/SC阳性细胞比例及pIgR/SC荧光强度均有所增加,并且随时间的延长这种增加的趋势更加明显。7、Western blot检测各组细胞SC蛋白表达：Glycyrrhizin呈剂量依赖性上调Caco-2细胞内SC蛋白表达,glycyrrhizin 20μg/L,100μg/L,500μg/L,1000μg/L处理组与对照组相比均具有统计学差异(P<0.05)；并且呈时间依赖性上调Caco-2细胞内SC蛋白表达。8h,16h,24h与0h组比具有统计学差异(P<0.05)。8、Real-time PCR检测各组细胞SC mRNA表达：Glycyrrhizin呈剂量依赖性上调Caco-2细胞内SC mRNA表达,glycyrrhizin 20μg/L,100μg/L处理组与对照组相比均具有统计学差异(P<0.05)；并且呈时间依赖性上调Caco-2细胞内SC mRNA表达。8h,16h,24h与0h组比具有统计学差异(P<0.05)。9、RU486对glycyrrhizin上调肠上皮细胞SC表达的影响：Glycyrrhizin 20μg/L与100nMDEX处理组Caco-2细胞内SC蛋白和SC mRNA表达增加,与对照组相比均具有统计学差异(P<0.05)。DEX联合RU486处理(阻断糖皮质激素受体)组与单独加DEX处理组相比SC蛋白和SC mRNA表达明显减少(P<0.05)。Glycyrrhizin联合RU486处理(阻断糖皮质激素受体)组与单独加glycyrrhizin处理组相比,SC蛋白和SC mRNA表达未见明显变化(P>0.05)。10、萤火虫荧光素酶报告基因检测SC基因启动子活性：Glycyrrhizin处理后海肾荧光素酶活性无明显改变,4h就可以看萤火虫荧光素酶活性明显增高,4h、8h、16h、24h组与对照组相比均具有统计学差异(P<0.05),16h组最高。11、Glycyrrhizin对SC启动子结合转录因子USF表达的影响：Glycyrrhizin处理后各组细胞间USF1及USF2蛋白表达均未见明显差异(P>0.05),与对照组相比,各组细胞USF1及USF2 mRNA表达也均未见明显变化(P>0.05)。结论1. Glycyrrhizin可以有效预防肝坏死小鼠肠上皮细胞损伤；2. Glycyrrhizin可以有效预防肝坏死小鼠肠SC蛋白表达减少,改善肝坏死小鼠肠粘膜免疫稳态失调,从而保护肠粘膜上皮细胞损伤；3. Glycyrrhizin诱导了肝坏死小鼠肠SC基因表达,使SC蛋白合成增加；4. Glycyrrhizin使得Caco-2细胞pIgR/SC阳性细胞比例及pIgR/SC荧光强度增加；5. Glycyrrhizin剂量依赖性及时间依赖性上调Caco-2细胞SC蛋白表达；6. Glycyrrhizin通过诱导Caco-2细胞SC mRNA水平,增加SC蛋白表达；7. Glycyrrhizin上调肠上皮细胞SC表达并非通过糖皮质激素受体；8. Glycyrrhizin可通过增强SC基因启动子活性来诱导Caco-2细胞SC mRNA转录,促使SC蛋白表达增加；9. Glycyrrhizin并非通过上调上游刺激因子(USF)的表达增强SC基因启动子活性。