哺乳动物胚胎生物技术的发展,对高质量卵母细胞的需求愈益增加。从体内获取成熟卵母细胞的数目有限,有必要深入理解卵泡发育和卵母细胞成熟的调控网络及机理。研究表明,在体外培养体系中添加适量雌二醇（E2）可促进卵母细胞的成熟。在雌性动物发情周期中,卵子发生与卵泡发育总是相伴发展的。只有当卵泡内激素和其他细胞因子达到合适的水平,卵母细胞才能发生减数分裂恢复,进一步发育成熟,其中E2的调节作用至关重要。已有的研究表明,E2调节哺乳动物生殖的过程是由雌激素受体介导的,一方面E2通过核受体调控靶基因转录,另一方面G蛋白偶联雌激素受体（GPER）可以快速介导E2的非基因组效应。本试验首先探究GPER在猪卵泡中的分布与表达,之后应用猪卵母细胞体外培养模型,通过添加E2、GPER特异性激动剂G1以及抑制剂G15,研究GPER对猪卵母细胞体外成熟的影响,进而深入探究PI3K/AKT信号通路在GPER作用中的地位,为了解E2参与哺乳动物卵泡发育与卵母细胞成熟调控的机制提供实验依据。主要的研究内容与结果如下:1、猪各级卵泡GPER的分布与表达本试验旨在研究猪不同大小卵泡的G蛋白偶联雌激素受体（GPER）分布与表达。根据卵泡直径大小设置不同分组,分离直径<3 mm、3-5 mm及>5 mm猪健康有腔卵泡,分别收集各组卵泡COC、卵泡液与卵泡壁。通过ELISA检测卵泡液中雌二醇浓度,免疫组化和WB检测GPER.在卵巢中的分布及相对表达水平,间接免疫荧光结合共聚焦显微镜观察检测卵泡COC中GPER的定位。结果表明,随着卵泡直径增大,卵泡液中雌二醇浓度逐渐升高;免疫组化检查表明,GPER免疫反应阳性产物分布于猪不同大小卵泡的颗粒细胞、泡膜细胞、卵丘细胞、卵黄膜和卵母细胞胞质中,以>5 mm卵泡组颗粒细胞分布最多,着色最深;GPER蛋白相对表达量随着卵泡的发育而逐渐提高;共聚焦图像显示GPER在猪卵泡COC中主要定位在卵丘细胞膜上,在卵母细胞中呈现全细胞着色但着色较浅。本试验表明,GPER在猪不同大小卵泡的分布和表达量变化与卵泡的发育过程大体一致,提示其可能介导了雌激素调节猪卵泡发育与卵母细胞成熟的过程。2、GPER对猪卵母细胞体外成熟的影响为了解GPER对猪卵母细胞体外成熟的影响,用已建立的猪卵母细胞体外培养模型,通过筛选GPER天然配体E2、GPER特异性激动剂G1和抑制剂G15三种药物的最适作用浓度,进而设置5个组,分别为对照组、E2组、G1组、G15组和E2+G15组。WB检测GPER蛋白相对表达水平,然后统计不同组猪卵母细胞体外培养后的第一极体排出率,评估其卵丘扩散状况并计算卵丘扩展指数,最后RT-qPCR检测卵丘扩散相关基因Has-2、Pgr、Ptgs-2和Ptx-31 mRNA的相对表达量。结果表明,E2和G1作为GPER的直接配体,可显著提高GPER蛋白表达水平,而这一作用在GPER受到抑制时明显削弱（P<0.05）;GPER激活促进了猪卵母细胞体外成熟和卵丘细胞扩散,GPER抑制阻碍了猪卵母细胞体外成熟和卵丘细胞扩散,其卵丘扩散相关基因的表达水平也有明显变化。这些结果提示,在体外培养体系中,E2可通过调节GPER表达,促进猪卵母细胞的成熟。3、雌二醇（E2）激活GPER经PI3K/AKT通路调控猪卵母细胞成熟为探究E2通过GPER促进猪卵母细胞成熟的机制,侧重研究PI3K/AKT信号通路与GPER介导猪卵母细胞成熟的关系。以猪卵母细胞体外培养模型,筛选PI3K特异性抑制剂的最适作用浓度,进而设置6个组,分别为对照组、E2组、G15组、E2+G15组、LY294002组及E2+LY294002组。首先WB检测AKT蛋白的磷酸化水平分析E2是否能通过GPER激活PI 3K/AKT信号通路,继而检测GPER蛋白相对表达量,最后进行表型验证。结果表明,E2显著提高p-AKT/AKT相对表达水平,G15或LY294002处理则可显著降低p-AKT/AKT的表达;在E2+G15和E2+LY294002共处理组中,E2的诱导作用受到明显阻滞（p<0.05）;E2显著提高GPER蛋白相对表达水平（p<0.05）,与G15抑制效果不同的是:LY294002处理组中GPER表达未受到明显抑制（p>0.05）,在E2+LY294002共处理组中,E2的诱导作用仍然存在;E2可以显著提高体外培养猪卵母细胞极体率和卵丘扩散水平（p<0.05）,当单独添加G15或者LY294002后,卵母细胞极体率和卵丘扩散程度显著降低（p<0.05）,E2+G15和E2+LY294002共处理组中,E2的诱导作用减弱。综合以上结果发现,E2可通过GPER激活PI3K/AKT信号通路,促进猪卵母细胞体外成熟和卵丘细胞扩散。