【摘 要】
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乳腺炎是奶牛养殖业中最为常见、最难防治、花费最多,严重制约乳业发展的疾病之一。乳腺炎不仅造成奶牛产乳量和乳品质降低,而且潜在危害人类健康。促红细胞生成素（EPO）是一种多效性生长因子,参与多种组织细胞的氧化反应、凋亡、炎症和自噬活动调节。乳腺炎易造成奶牛乳腺组织损伤和炎症的发生,EPO与奶牛乳腺炎的研究报道较少。本论文从EPO参与细胞自噬和凋亡调节的角度,基于细胞自噬和凋亡的重要调节信号通路PI3
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（32172809）“SIRT5通过AMPK/mTOR信号调节氨诱导奶牛乳腺上皮细胞的自噬反应”; 河南省科技攻关计划（212102110355）“大肠杆菌噬菌体治疗奶牛乳房炎的研究及推广应用”
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乳腺炎是奶牛养殖业中最为常见、最难防治、花费最多,严重制约乳业发展的疾病之一。乳腺炎不仅造成奶牛产乳量和乳品质降低,而且潜在危害人类健康。促红细胞生成素（EPO）是一种多效性生长因子,参与多种组织细胞的氧化反应、凋亡、炎症和自噬活动调节。乳腺炎易造成奶牛乳腺组织损伤和炎症的发生,EPO与奶牛乳腺炎的研究报道较少。本论文从EPO参与细胞自噬和凋亡调节的角度,基于细胞自噬和凋亡的重要调节信号通路PI3K/Akt/m TOR,开展EPO对乳腺炎症和损伤的影响研究。以奶牛乳腺上皮细胞（MAC-T）为研究对象,利用脂多糖（LPS）建立炎症乳腺上皮细胞模型,结合外源EPO处理细胞。MTT、CCK-8、Western blot、RT-PCR、ELISA、Annexin V FITC/PI、透射电镜等方法评价EPO对细胞增殖、炎症反应、凋亡和自噬活动的影响;结合PI3K或m TOR抑制剂的处理,揭示EPO调控奶牛乳腺上皮细胞自噬和凋亡的分子机制。结果如下:EPO对MAC-T细胞增殖和炎症反应的影响:MTT和CCK-8法的结果表明,100 U/m L EPO处理MAC-T细胞12 h,能显著提升细胞活力,促进细胞增殖。100 U/m L EPO抑制LPS上调MAC-T细胞中IL-6、IL-8、TNF-αm RNA和蛋白的表达。提示EPO能促进细胞增殖,降低LPS诱导MAC-T细胞的炎症反应,后续试验选100 U/m L EPO处理MAC-T细胞12 h。EPO对MAC-T细胞自噬和凋亡的影响:Western blot和RT-PCR结果表明,EPO降低LPS处理MAC-T细胞中LC3B、Beclin1、Bax和Caspase-3 m RNA水平,提高LPS处理MAC-T细胞中p62和Bcl-2 m RNA水平,同时LC3II/LC3I比值、Beclin1、Bax、Caspase-3蛋白表达下降,p62和Bcl-2蛋白表达上升;Annexin V FITC/PI结果显示,EPO抑制LPS诱导的MAC-T细胞凋亡数目;透射电镜结果发现,EPO和LPS共处理后,细胞内自噬溶酶体数量明显减少。提示EPO对LPS诱导的MAC-T细胞自噬和凋亡具有抑制作用。PI3K/Akt/m TOR信号介导EPO调节MAC-T细胞自噬和凋亡:p-Akt、p-m TOR、p-4EBP1和p-70S6K蛋白检测结果表明,LPS能抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路的活动;EPO能激活PI3K/Akt/m TOR信号通路,逆转LPS阻断的PI3K/Akt/m TOR信号通路作用;阻断PI3K或m TOR信号,EPO不能抑制LPS诱导MAC-T细胞中IL-6、IL-8、TNF-α的表达;细胞自噬和凋亡相关分子检测结果表明,阻断PI3K/Akt/m TOR信号通路后,EPO的抗凋亡（抑制Bax和Caspase-3 m RNA和蛋白的表达,促进Bcl-2 m RNA和蛋白的表达）和抗自噬（抑制LC3B和Beclin1 m RNA和蛋白的表达,促进p62 m RNA和蛋白的表达）作用减弱,流式细胞术结果显示,PI3K或m TOR抑制剂明显改变EPO减少凋亡的作用。提示PI3K/Akt/m TOR信号参与EPO对LPS诱导的MAC-T细胞自噬和凋亡的调控。综上,EPO促进细胞增殖,降低LPS诱导MAC-T细胞的炎症反应;EPO通过PI3K/Akt/m TOR信号抑制LPS诱导的MAC-T细胞自噬和凋亡作用。
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