熏蒸剂对姜根际细菌群落结构的影响及姜内生细菌的多样性分析

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本文在山东泰安邱家店布置试验,分别在生姜种植期、苗期、旺盛生长期前期、后期和根茎膨大期前期、后期采集无熏蒸剂处理、溴甲烷熏蒸、氯化苦熏蒸的生姜根际土壤样品。采用T-RFLP和构建16S rDNA文库的方法,并且结合RDA,CCA等统计学方法探讨了使用熏蒸剂对生姜根际细菌群落结构的影响,并且筛选生姜内生有益细菌研究其遗传多样性。T-RFLP分析表明,使用熏蒸剂处理后的土壤中,在生姜的种植期和苗期,细菌的多样性要明显低于没有使用熏蒸剂处理的样品;而当进入旺盛生长期之后,熏蒸剂效果逐渐减弱,根际土壤中的细菌种类和数量又开始逐渐增加,当进入根茎膨大期后期之后,使用熏蒸剂处理过的生姜根际土壤细菌的多样性仍然要比无处理的样品要低。16S rDNA克隆文库的结果显示,经过氯化苦处理的土壤样品中,在生姜的种植期,占优势的菌群为厚壁菌门(21.1%)和γ-变形杆菌门(36.8%),而无处理的土壤样品中这两种菌并不占优势,无处理的土壤样品中占优势的菌群为放线菌门(25.9%)和拟杆菌门(37%)。而且,在种植期时与无处理的土壤样品相比,氯化苦处理过的土壤样品中少了放线菌门和芽单胞菌门;在苗期时,缺少了芽单胞菌门、疣微菌门、浮霉菌门和硝化螺菌门,说明熏蒸剂的使用严重影响了生姜根际土壤中的细菌群落结构。通过对土壤样品理化性质的测定,我们发现,在生姜的种植期以及苗期,使用熏蒸剂熏蒸后的土壤中,有机质的分解速率和腐殖质的降解速率都要比无处理的低很多,而且对速效磷、速效钾以及铁锰铜锌等微量元素的积累速率和积累量都产生了严重的影响,虽然后期随着微生物种类的逐渐恢复,这一影响有所减弱,但是,使用熏蒸剂严重影响了土壤中的各矿物元素的互相转化,不仅影响了生姜的正常生长,而且容易使土壤板结。采用R2A培养基分离生姜内生细菌,结果显示,生姜内生细菌的数量在10.4×104cfu/g FW到20.2×104cfu/g FW之间,内生细菌的最大数量出现在生姜的苗期。结合菌落和细菌形态观察,我们共分离得到了248株内生细菌,其中90株具有产吲哚乙酸(IAA)的能力,而17株具有拮抗能力。根据ARDRA和16S rDNA分析,这107株内生细菌共分为16个属。其中芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)以及肠杆菌属(Enterobacter)是优势菌群,而且内生细菌多样性最高的时期是苗期,这与菌落计数的结果是一致的。17株具有拮抗效果的内生细菌中,16株对生姜茎腐病具有拮抗效果,6株对生姜半点病有拮抗效果,其中芽孢杆菌是拮抗菌的优势菌种。在产IAA的内生细菌中,荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、巨大芽孢杆菌(B. megaterium)以及Enterobacter ludwigii具有最高的产吲哚乙酸的能力。使用滤纸片法检测具有生防功能的内生细菌是否能够被鲜姜汁的抑制的实验发现,只有少数几株能够被抑制,而且大部分是在苗期分离到的,包括:Roseateles depolymerans, Chryseobacterium taiwanense, E.ludwigii, Agrobacterium larrymoorei, P. fluorescens,和B. amyloliquefaciens。说明随着生姜的生长其自身产生抑菌物质的增加,生姜内生细菌菌群适应了姜辣素等抑菌物质。本实验共获得了107株促生和拮抗菌种,为菌种资源的开发奠定了基础。
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