本研究旨在将人乳铁蛋白基因乳腺特异性表达载体PBLM-C1,用脂质体法转染体外培养的沙能奶山羊乳腺上皮细胞,应用G418筛选及PCR检测获得阳性细胞,并对细胞进行激素(催乳素+胰岛素+氢化可的松)诱导,Western blot检测细胞上清液有目的蛋白表达。之后以该转染细胞为供核体细胞进行核移植试验,并对转基因克隆胚在早期发育过程中外源基因的表达进行PCR检测,为获得转基因动物个体奠定基础。研究结果如下:1.原代培养的山羊乳腺上皮细胞,大多细胞形态呈短梭型、多角形,也有部分呈圆饼状,体积较大,体外培养过程中可形成岛屿状单层聚集和类似圆顶状的结构。传至第三代进行细胞转染实验。2.纯化的质粒载体和质脂体依据一定的比例混合后,转染体外培养的山羊乳腺上皮细胞,经脂质体转染的细胞克隆形成率较高,可见到阳性细胞形成的岛屿状细胞群。3.利用脂质体法转染体外培养的山羊乳腺上皮细胞,400μg/mL的G418的培养液连续筛选2周,然后用200μg/mL的G418低浓度培养。转染细胞提取基因组DNA进行PCR鉴定,电泳结果表明该载体成功转入细胞中。4.对转染的细胞进行激素诱导,加入含胰岛素(5mg/L)、催乳素(5mg/L)、氢化可的松(1mg/L)的培养液进行诱导培养,每隔6h收集一次上清液,经1000r/min离心10～15 min后,将上清液进行浓缩,-20℃保存。上清液经Western blot检测有目的蛋白表达,分子量为42ku。5.筛选的阳性细胞作为供体细胞,电融合法构建转基因克隆胚,进行核移植试验。对克隆胚进行PCR检测,证明外源基因已整合到转基因克隆胚中。结果共得到48个阳性克隆株,对其中的10株进行了细胞核移植,得到93个克隆胚,其中8个发育到囊胚阶段,囊胚率为8.60%。