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研究目的:表观遗传修饰中甲基化状态的改变是致癌作用的一个关键因素,启动子区CpG岛发生高甲基化是导致抑癌基因及肿瘤相关基因失活的一种主要机制。环境变化改变基因表观遗传修饰是目前研究的热点,本论文选择环境物质中木质素类植物雌激素NDGA,研究其对人肿瘤细胞系及人乳腺裸鼠移植瘤模型中抑癌基因启动子高甲基化的影响,初步探讨其抑瘤的表观遗传修饰机制。研究方法:选择甲基化背景清楚的人类乳腺癌细胞系T47D、MDA-MB-435、SKBR3和结肠癌细胞系RKO为研究对象,应用甲基化特异性PCR(Methylation-specificPCR,MSP)、T-A克隆及DNA测序分析甲基化状态,四唑盐(MTT)比色、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白印迹(Western blot)方法检测用药前后NDGA对四种肿瘤细胞系增殖、活力的影响,以及对抑癌基因p16、E-cad mRNA及蛋白表达的影响。流式细胞仪检测NDGA作用于p16基因高甲基化沉默的两株细胞系T47D和RKO细胞周期变化情况,Western检测G1期中发挥主要作用的细胞周期相关蛋白CyclinD1及pRB蛋白的表达。β-半乳糖苷酶活性测定检测p16表达后诱导肿瘤细胞衰老的情况。选雌性nu/nu裸鼠,予腋窝注射培养的人乳腺癌细胞MDA-MB-435细胞,建立人乳腺癌移植瘤动物模型。动物实验中分为两组,NDGA治疗组和对照组,每组5只,观察NDGA对人乳腺癌移植瘤的生长抑制作用计算抑瘤率,定期测量裸鼠体重,以末体重/初体重(FBW/IBW)作评价指标,判断其有无毒性反应。MSP检测NDGA在裸鼠体内能否逆转抑癌基因E-cad启动子区高甲基化状态,RT-PCR结合免疫组织化学染色法检测E-cad mRNA及蛋白表达情况。结果:(1) MSP结果提示未经NDGA作用的对照组肿瘤绌胞系T47D、RKO的p16基因和SKBR3、MDA-MB-435的E-cad基因是高度甲基化的。4组不同浓度NDGA处理的四种肿瘤细胞系与对照组相比,MTT结果均显示NDGA能明显抑制肿瘤细胞的增殖,T47D、RKO、SKBR3和MDA-MB-435的IC50分别为51.17,33.4,31.09和38.8;p16和E-cad这两个抑癌基因启动子区高甲基化的状态发生逆转并呈剂量-时间依赖趋势;RT-PCR、蛋白印迹显示甲基化沉默的抑癌基因p16、E-cad恢复表达,呈剂量依赖性趋势。(2)流式细胞仪结合β-半乳糖苷酶活性测定分析p16恢复表达后的功能恢复情况。细胞周期数据显示NDGA作用于T47D和RKO细胞系144小时后,随着药物浓度增加,G1期细胞增加,G1期阻滞明显。Western检测G1期起关键作用的细胞周期相关蛋白,结果显示pRB磷酸化程度、CyclinD1的表达随剂量增加呈降低趋势。细胞衰老经典实验β-半乳糖苷酶活性测定显示,NDGA处理组与对照组相比β-半乳糖苷酶活性增高,且随加药剂量增加,细胞衰老比例显著增加。(3)利用培养的人乳腺癌MDA-MB-435细胞,成功的建立了人乳腺癌裸鼠移植瘤模型。实验中NDGA处理组与溶剂对照组裸鼠相比具有良好的抑瘤效果,药物毒性评价实验检测指标提示NDGA治疗过程中,无毒性效应。MSP、RT-PCR和免疫组化检测结果提示NDGA逆转了抑癌基因E-cad启动子区的高甲基化状态,恢复了E-cad的表达。结论:本论文显示NDGA对人肿瘤细胞系和裸鼠移植瘤的模型具有良好的抑制肿瘤作用,提示逆转抑癌基因启动子甲基化,恢复抑癌基因功能表达在NDGA抗瘤过程中发挥了重要作用。由于动物荷瘤模型可以反应抗肿瘤物质经过动物体内代谢后的抗肿瘤活性及一般毒性情况,从整体水平说明抗肿瘤药物的有效性,本论文的人乳腺癌细胞系MDA-MB-435裸鼠移植瘤动物实验结果,为NDGA进一步应用于临床提供了良好的证据。