间质性疾病是以肺组织炎症细胞浸润、成纤维细胞增殖、细胞外基质与胶原进行性积聚为病理特征,最终取代正常肺组织结构而严重影响肺功能、临床预后较差的一类疾病,以特发性肺纤维化较为常见。但其发病机制仍不明,临床治疗缺乏有效方法。近年,我们采用白三烯抑制剂(leukotriene inhibitor, LTI)进行防治肺纤维化的实验研究,已明确LTI可延缓或抑制肺纤维化,但其机制尚不清楚,限制了LTI在临床的应用发展。本研究在我们过去的研究结果基础上,采用经典的气管内滴注博莱霉素诱导大鼠肺纤维化的方法复制肺纤维化动物模型,以LTI齐留通进行干预,探讨LTI拮抗博莱霉素所致大鼠肺纤维化形成的可能机制,为其进一步在临床的应用提供机制方面研究的实验依据。第一章白三烯抑制剂对肺纤维化的拮抗效应目的采用气管内滴注博莱霉素的方法制备大鼠肺纤维化模型、给予LTI齐留通对大鼠肺纤维化的形成进行干预,进一步观察大鼠动物模型肺纤维化形成过程中肺泡炎及肺纤维化的程度变化和LTI的干预效应。方法72只SD雄性大鼠随机数字法分为正常对照组(C组)、博莱霉素模型组(B组)和LTI处理组(T组),每组动物24只。B组和T组大鼠均采用气管内滴注BLMA5 (5mg/kg)复制肺纤维化动物模型,T组动物于造模当天始从胃管内灌入齐留通溶液(100mg/kg/d), B组动物以生理盐水0.5ml/100g/d灌胃作为T组动物的干预对照；C组动物的处置与B组和T组动物的模型复制过程相同,但以等量生理盐水代替博莱霉素于气管内注入,且以等量生理盐水代替齐留通溶液灌胃。各组动物均在制模开始后第7d、14d、28d分别随机处死8只动物,取左肺下叶组织制作腊块行病理切片HE染色和Masson染色,显微镜下观察肺泡炎和肺纤维化程度,碱水解法检测肺组织羟脯氨酸浓度,免疫组化技术检测大鼠肺组织α-SMA水平。结果(1)肺系数：B组在气管内滴注博莱霉素后肺系数各观察时间点均明显高于C组(p<0.01),T组动物在LTI干预后在各观察时间点均较B组下降(p<0.05)。(2)肺组织肺泡炎程度(HE染色)评分：C组在各观察时间点评分均低；B组较C组在各观察时间点评分均增高(第7天和第14天均p<0.01,第28天p<0.05)；T组在各观察时间点评分均较B组为低(p<0.05),但较C组仍高(p<0.05)。(3)肺组织肺纤维化程度(Masson染色)评分：C组在各观察时间点评分均低；B组与C组相比在各观察时间点评分均有增高(第7天p<0.05,第14天和第28天均p<0.01)；T组在第14天和第28天的评分均较B组为低(p<0.05和p<0.01),但在各观察时间点的评分仍高于C组(p<0.05)。(4)肺组织羟脯氨酸(Hyp)含量：制模后第7天,三组动物的含量在各观察时间点均无显著性差异(p>0.05)；第14天和第28天B组均较C组增高(p<0.01)；第14天T组较B组减低(p<0.05),第28天T组较B组减低更明显(p<0.025)。(5)肺组织α-SMA蛋白的表达：B组和T组与C组相比,第7天表达水平无明显差异；第14天和第28天B组较C组表达明显增强(P<0.01)；T组在第14天和第28天均较B组减弱(分别p<0.05和<0.01),但表达仍较C组为强(P<0.01)结论1.BLM气管内滴注可成功复制大鼠肺纤维化动物模型。2.白三烯参与大鼠肺纤维化动物模型形成过程中早期肺泡炎的产生和后期肺纤维化的形成。3.LTI可降低肺纤维化大鼠肺组织匀浆中羟脯氨酸的含量、降低大鼠肺纤维化模型肺组织的胶原代谢、减轻大鼠肺纤维化模型形成过程中早期肺泡炎和后期肺纤维化的程度。第二章白三烯抑制剂对肺纤维化TH1/TH2类细胞因子的作用目的观察TH1和TH2细胞的特征性细胞因子IFN-γ和IL-4在博莱霉素所致大鼠肺纤维化形成过程中肺组织中的变化,探讨LTI对IFN-γ和IL-4的影响,观察LTI有无调节TH1/TH2细胞因子失衡作用。方法博莱霉素所致大鼠肺纤维化模型的制备和LTI的干预步骤和方法同第一部分。取C组、B组和T组大鼠右肺冻存于-70℃冰箱备用。检测时取肺组织制成匀浆,低温离心后取上清液按照ELISA试剂盒使用说明检测肺组织Cys-LTs、LTB4、IL-4和INF-γ的浓度。结果1.肺组织cys-LTs含量：B组与C组肺组织中Cys-LTs含量相比,各观察时间点的含量均有增高(p值均<0.001),以第7天含量最高,第28天含量最低；T组较B组含量在各观察时间点相比均有降低,第7天相比和第28天相比均有降低(p<0.05),第14天相比有显著降低(p<0.025),但T组与C组含量相比在各观察时间点仍有显著增高(第7天相比p<0.001,第14天相比p<0.005,第28天相比p<0.05)。2.肺组织LTB4含量：B组含量在各观察时间点与C组含量相比均明显增高(p<0.001)；T组与B组相比,各观察时间点的肺组织中LTB4含量均显著降低,以第7天和第14天降低最显著(p<0.005),第28天相比也明显降低(p<0.025)；但T组与C组相比含量仍有增高,以第7天和第14天相比增高较显著(p值均<0.001),在第28天相比稍有增高(p值<0.05)。3.肺组织INF-γ(Elisa结果)浓度：B组较C组相比在各观察时间点均有降低,以第28天下降最明显(p值均<0.001)；T组较B组相比在各观察时间点均有增高,以第7天和第28天时增高较为明显(分别p<0.005和p<0.001),第14天相比稍有增高(p<0.05)。但在各观察时间点相比均仍高于C组,以第14天和第28天含量差异较为明显(p<0.005和p<0.001)。4.肺组织IL-4(Elisa结果)浓度：B组第7天即开始增高,至第28天含量最高,与C组相比在各观察时间点均显著增高(均p<0.001)；T组与B组相比各观察时间点含量均显著降低(p<0.005),但仍高于C组,以第14天(p<0.005)和第28天较明显(p<0.001)。结论1.LTI可减少博莱霉素所致大鼠肺纤维化动物模型肺组织匀浆中Cys-LTs、LTB4的含量。2.LTI可增高博莱霉素所致大鼠肺纤维化动物模型肺组织匀浆中TH1细胞因子INF-γ增高和TH2细胞因子IL-4。3.LTI可-能通过调整TH1/TH2细胞因子的平衡减轻肺纤维化早期肺泡炎的程度。第三章LTI对肺纤维化时TGF-β信号转导分子Smads蛋白表达的影响目的采用原位杂交技术,观察TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7在博莱霉素所致大鼠肺纤维化模型肺纤维化发生发展过程中的表达变化,探讨LTI对上述信号蛋白表达的影响。方法博莱霉素所致大鼠肺纤维化模型的制备和LTI的干预步骤和方法同第一部分。取C组、B组和T组大鼠左肺下叶组织制作腊块并切片,采用链霉素亲和素-过氧化物酶(SABC)法免疫组化染色检测TGF-β的表达,并采用DIG(地高辛)标记的探针原位杂交法检测肺组织中Smads的mRNA表达(参照试剂盒说明书进行)结果1.肺组织TGF-β1的表达结果：第7天、第14天和第28天的表达B组和T组均较C组明显为强(p<0.001),以第7天的表达最为明显,且个观察时间点的表达T组均较B组为弱(p<0.05)。2.肺组织中Smad2/3的表达：多在巨噬细胞、肺II型上皮细胞、成纤维细胞和增生细支气管上皮细胞胞浆内表达；C组动物肺组织Smad3的表达在第7、第14和第28天三个观察时间点均无明显变化；B组动物与C组动物相比在各观察时间点肺组织Smad3的表达均有增高,且在第7天即有增高(p<0.005),第14天表达增高最明显(p<0.001)；T组较B组相比在各观察时间点的表达均有减低(p<0.05),但仍高于C组在各观察时间点的表达(均p<0.05)。3.肺组织Smad4的表达：与Smad2/3的表达情况类似,Smad4多表达在巨噬细胞、肺II型上皮细胞、成纤维细胞和增生细支气管上皮细胞胞浆内；B组在各观察时间点的表达均明显高于C组(P<0.001),T组与B组相比在各观察时间点的表达均明显降低(p<0.05),但仍显著高于C组(P<0.005)。4.肺组织Smad7的表达：与Smad2/3和Smad4的表达情况相反,多在巨噬细胞、肺II型上皮细胞、成纤维细胞和增生细支气管上皮细胞的细胞核内表达；B组在各观察时间点与C组相比均显著低于C组(P<0.001),第7天即减低,第14天表达最低,第28天又明显增高；T组的表达在第7、14和28天均较B组的表达有所增高(均P<0.05),然而在各观察时间点的表达仍低于C组(P≤0.005)。结论：1.博莱霉素所致大鼠肺纤维化动物模型肺组织内TGF-β1的表达增强,LTI可减低博莱霉素所致大鼠肺纤维化动物模型肺组织TGF-β1的表达。2.博莱霉素所致大鼠肺纤维化动物模型肺组织的巨噬细胞、肺II型上皮细胞、成纤维细胞和增生的细支气管上皮细胞胞浆内R-Smad(Smad3)和Co-Smad(Smad4)的表达增强而细胞核内I-Smad(Smad7)的表达减低,LTI可减低上述细胞胞浆内R-Smad (Smad3)和Co-Smad(Smad4)的表达增强并增强上述细胞细胞核内I-Smad(Smad7)的表达,减缓肺纤维化的形成。