玻璃化法超低温保存(Vitrification)是将材料置于玻璃化溶液(Plant Vitrification Solution,PVS)中,使其在快速冷冻过程被固化成玻璃态,并以这种状态在超低温下保存,是植物种质资源中长期保存的首选方法。玻璃化法超低温保存中的逆境胁迫是造成保存材料致死的主要原因,通过外源物质辅助PVS来抑制胁迫损伤是常用的提高冻后成活率的方法。因此,超低温保存过程中的代谢活动、胁迫响应以及外源物质调控机制研究对超低温保存有着重要的意义。本论文以拟南芥(Arabidopsis thaliana)幼苗为研究对象,对比研究不同苗龄幼苗超低温保存过程中的代谢产物动态变化以及基因差异表达情况,以探讨不同苗龄幼苗对超低温保存的胁迫响应差异;同时适量添加外源物质以优化超低温保存体系,并在生理和转录层面研究外源物质对玻璃化法超低温保存的调控机制,进一步丰富超低温保存的逆境分子生物学理论,从而为其它植物超低温保存技术体系的建立及优化提供理论依据。1)在拟南芥幼苗玻璃化法超低温保存研究中发现,幼苗苗龄与超低温保存恢复生长率呈显著负相关关系,关系曲线与Logistic方程的拟合度较高,并且曲线的拐点苗龄为58.74 h。细胞活性原位检测发现恢复生长率为96.8%的48 h幼苗在超低温保存过程中保持着较为完整的膜结构和较高的细胞活性,并且可以较快地从超低温保存损伤中恢复;而保存后近乎全部死亡的72 h幼苗细胞活性则较低,并且在恢复培养阶段损伤程度没有改善,根部的成熟区和伸长区仍遭受着严重的膜损伤。2)在不同苗龄幼苗超低温保存生理生化研究中发现内源物质在超低温保存过程中存在差异响应。72 h幼苗在渗透保护和脱水(渗透–脱水)过程中活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)水平明显升高,尤其是产生羟自由基能力增加了1.62倍,同时膜脂过氧化终产物丙二醛含量增加到近2倍,72 h幼苗经受着较为严重的氧化胁迫损伤,相关性分析表明丙二醛含量与恢复生长率呈显著负相关关系,氧化胁迫可能是导致超低温保存失败的原因之一。2种苗龄幼苗大部分可溶性糖组分的含量在渗透–脱水后有所增加,且48 h幼苗增量大于72 h幼苗。具有生物活性的顺式脱落酸在2种苗龄幼苗处理过程中含量变化幅度很小,但48 h幼苗的脱落酸含量始终高于72 h幼苗;生长素含量在48 h幼苗中上升了近1倍,而72 h幼苗则没有显著变化。内源激素原位检测发现,脱落酸信号在处理过程中没有明显增强,一直处于较低水平;而生长素信号在48 h幼苗渗透–脱水过程中则显著增强,并主要分布在子叶、根部的成熟区和伸长区。在渗透–脱水过程中,72 h幼苗严重的膜脂过氧化,以及生长素、可溶性糖等内源物质对48 h幼苗提供更多的保护来抵御氧化胁迫,都可能是导致两种苗龄幼苗恢复生长率差异的原因。3)为了进一步分析苗龄与恢复生长率呈显著负相关的原因,利用c DNA-AFLP技术对比研究了48 h和72 h幼苗经过渗透–脱水后基因差异表达情况。64对引物组合分离得到的145条EST序列作为首批植物超低温保存相关序列已提交Gen Bank数据库。48 h幼苗渗透–脱水前后比较转录分析表明,53%的差异表达基因包含在胁迫响应、蛋白合成与代谢、代谢与能量中;而72 h幼苗中差异表达基因则主要包含在运输、信号、细胞组织和生物合成中,说明超低温保存过程中不同苗龄幼苗在转录层面的响应存在明显差异。挑选出54个基因进行表达定量分析,并根据基因表达模式进行了聚类分析,共聚为5类。在差异表达基因中,胁迫响应基因尤其是氧化胁迫响应相关基因在渗透–脱水过程中发挥了重要的作用,进一步证明了氧化胁迫是导致材料死亡的重要原因,并且由于膜脂过氧化造成的质膜损伤,使得光合和氧化磷酸化相关基因下调表达。此外,通过细胞凋亡关键基因(DAD1)的差异表达分析发现,72 h幼苗在渗透–脱水过程中发生了细胞凋亡,而48 h幼苗则有效地抑制了细胞凋亡的发生。2种苗龄幼苗在超低温保存过程中均经受着氧化胁迫,48 h幼苗可以有效地抵御氧化胁迫并保持较高的恢复生长率。4)外源添加物质对于降低超低温保存过程中的胁迫损伤有着重要的作用。接近苗龄与恢复生长率关系曲线拐点的60 h幼苗是筛选有效外源物质并研究其调控机理的重要材料。分别在60 h幼苗超低温保存PVS2中添加9种外源物质,其中优化效果最好的抗氧化剂维生素C(VC)可提高恢复生长率近2倍。通过60 h幼苗非优化和VC优化的超低温保存体系抗氧化生理分析发现,H2O2是导致超低温保存氧化伤害的主要ROS组分,并分布在子叶、茎尖以及根部的成熟区和伸长区。在非优化超低温保存过程中,ROS水平持续升高并于解冻后达到最大值,大量的ROS激发了幼苗抗氧化系统的响应,内源VC含量和过氧化氢酶活性也随之升高,同样在解冻后达到峰值,但由于氧化胁迫过于严重,内源抗氧化剂的响应没能有效地降低膜脂过氧化程度,丙二醛含量亦在解冻后达到了最大值,标志着生物质膜严重受损,并导致大量细胞死亡。而添加外源VC的脱水过程则提高了内源VC含量和过氧化物酶活性,使幼苗在投入液氮前保持着较高的抗氧化水平和较低的氧化损伤程度,最终使优化体系的幼苗在冻融、洗涤和恢复培养阶段一直保持着低于非优化体系的ROS水平和膜脂过氧化程度,这也造成了两个超低温保存体系恢复生长率的差异。5)利用拟南芥表达谱芯片进行60 h幼苗非优化和VC优化的超低温保存体系比较转录组学分析可以深入地研究外源物质的分子调控机理。韦恩分析发现优化脱水过程的特有差异表达基因是非优化体系的近10倍,但优化的冻融和洗涤过程特有差异表达基因数量仅为非优化体系的42%。超低温保存体系通路富集分析表明细胞壁和脂类代谢参与了渗透保护过程,而其它代谢响应则相对较弱。在非优化超低温保存脱水过程中,苯丙素类及萜类化合物代谢有所提高,氨基酸合成与代谢明显下调。冻融过程使次生代谢产物的生物合成、氨基酸代谢、脂类物质代谢和能量代谢等下调。在洗涤过程中,多种代谢过程继续下调,其中包括光合作用和生物异源物质代谢,但非生物胁迫响应在洗涤阶段则没有显著差异表达。在恢复培养24 h过程中,部分代谢和调控相关基因以上调表达为主,但光合仍小幅下调。碳水化合物代谢、辅助因子和维生素代谢均参与到恢复培养初期的代谢响应中。在优化超低温保存脱水过程中,细胞壁、脂类、光合和次生代谢相关基因下调表达。优化体系恢复培养初期与非优化体系不同的是,更多的代谢和调控过程出现了减弱的情况,降低了拟南芥幼苗冻后恢复生长的代谢活动,有利于幼苗尽快修复损伤并调整正常代谢过程。6)在超低温保存非生物胁迫信号的感应和转导过程中,作为重要的胁迫信号感知蛋白激酶的组氨酸激酶在非优化体系渗透保护、脱水和冻融过程上调表达,而在优化体系的渗透保护和脱水阶段上调表达。促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)中参与渗透保护胁迫信号转导的为MAPK11,另有MAPK20参与到冻融过程,优化的脱水过程中MAPKKK13特异性参与信号转导,两个体系的恢复培养初期均有大量的MAPKs参与并以上调表达为主。CBF2在两个体系中均于脱水后达到峰值,其它DREBs在非优化体系中虽呈整体上调表达趋势,但特异性地在脱水后出现最低值,而优化体系中DREBs则持续上调表达。因此,优化体系中的非生物胁迫响应比非优化体系更为积极,尤其是脱水阶段的胁迫信号转导较强,这也使幼苗更好地适应了复合胁迫环境,有利于应对之后的冷冻等一系列胁迫处理。外源VC对超低温保存过程中ROS信号转导亦存在重要的调控作用。ROS首先通过受体蛋白启动下游钙离子信号。非优化体系中钙依赖信号转导因子以下调表达为主,而优化体系中的钙结合蛋白则以上调为主。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在ROS信号转导中起到核心作用,它在非优化体系洗涤阶段下调表达,但在优化体系中则持续上调表达。一些重要的ROS调控相关转录因子在优化体系中亦上调表达,这可以更好地将ROS信号传递到通路下游。ROS信号转导下游一方面有着积极的扩增循环,另一方面是ROS清除网络。优化体系激活下游扩增循环的同时,ROS清除基因的响应也更为积极,这使优化体系中幼苗的ROS信号保持着较为平衡、稳定的水平,也决定了2个超低温保存体系中的幼苗所承受ROS诱导的氧化胁迫程度的差异,并最终导致恢复生长率的差异。