肌腱钙化为临床中常见疾病,常并发于肌腱损伤或手术之后,或作为肌腱病的一种特殊表现形式。肌腱钙化常发生于肩袖肌腱群、跟腱、肌腱及部分屈肌腱。肌腱钙化为肌腱病的组织学特点之一,常发生于严重的肌腱病中且常见于肩袖肌腱群。国内目前尚未肌腱钙化流行病学的数据,在欧洲人群中,肩袖肌腱群的钙化发生率为2.7-22%,其中最常发生于35-50岁女性,且10%的病例肌腱钙化发生在双侧。发生于跟腱肌腱病的钙化常见于年轻的运动员、或年龄较大、久坐或肥胖的病人。继发于肌腱病的肌腱钙化发生率尚不明确,有文献报道认为其发生率为5%。作为获得性异位骨化的一种表现形式,肌腱钙化与其他获得性异位骨化的病理特点的相同及不同之处尚不清楚。此外,临床回顾性研究提示肌腱钙化可能导致疼痛、肌腱无力、局部水肿以及不同程度的活动受限。然而,尚无直接证据表明肌腱钙化能够导致任何临床症状。肌腱钙化的发病机制尚不明确,目前存在若干种发病机制的假说,且若干种因素参与到肌腱钙化的发生过程。有学者认为肌腱损伤后,局部干细胞参与到肌腱的修复及钙化的发生过程中；损伤发生后,局部干细胞本应进行腱性分化从而参与肌腱的修复过程,然而由于损伤后肌腱局部的微环境发生改变,导致了局部干细胞发生成软骨／骨分化。然而尚不明确哪种局部干细胞参与到钙化的发生。钙化形成后,若保守治疗无效,唯一的治疗方式为手术治疗。所以相对于钙化形成后进行治疗,预防肌腱钙化的发生更为重要。然而,临床尚无明确的用于预防肌腱钙化的药物。目前,国内外学者对肌腱钙化这一临床常见问题并不重视,从而导致我们对于肌腱钙化的病理特点、发病机制以及如何预防并不清楚。因此,本课题旨在对肌腱钙化的发病机制及防治做一从基础到临床相关的系统性研究。旨在提高对于肌腱钙化的基础认识,从而指导临床治疗。第一章肌腱钙化动物模型的建立及验证目的：评价跟腱切断诱导的肌腱钙化模型是否稳定可靠,为之后采用该模型进行研究提供依据。方法：采用C57小鼠,麻醉后在无菌条件下在右后跟处皮肤做一约1厘米的纵向切口,暴露肌膜及跟腱。在跟腱中段横断跖肌腱及跟腱,缝合皮肤。术后放回笼中自由活动。术后10周时处死小鼠行小动物CT检测钙化体积。并行HE及阿尔新蓝染色明确组织学变化。结果：术后1周时跟腱中段可见大量炎性细胞浸润,可见少数肌腱细胞,细胞外基质较少。术后4周时,炎性细胞基本消失,取而代之的为大量肌腱细胞,细胞外基质较1周时明显增加,但细胞及新生肌腱结构排列紊乱。术后6周时,未见明显炎性细胞,细胞外基质较继续增加,但细胞及新生肌腱结构仍排列紊乱。术后10周时,可见较为完整的肌腱结构,细胞外基质明显增加,细胞及新生肌腱结构排列整齐。术后1周时,肌腱插入端可见少量阿尔新蓝阳性染色,而术后6周时可见明显阿尔新蓝阳性染色,且可见软骨细胞样细胞结构。术后10周时,肌腱插入端可见明显骨化组织形成。术后10周行gCT检测发现所有跟腱切断的小鼠均发生肌腱钙化,钙化主要发生于肌腱的插入部,即骨-腱结合处及肌腱-肌肉结合处。对钙化区进行定量分析后,4组间钙化大小无统计学差异(组1：0.455±0.189mm3；组2：0.411±0.175 mm3；组3：0.400±0.219 mm3；组4：0.426±0.185 mm3)(均数±标准差)(F=0.76)(P=0.972)(n=5)。小结：通过组织学观察证实了跟腱切断诱导的肌腱钙化为典型的插入部肌腱钙化,且其病理过程为软骨内成骨。本研究通过比较4组小鼠术后10周肌腱钙化的体积大小发现各组间骨化体积大小无统计学差异,证明跟腱切断诱导的肌腱钙化模型稳定且重复性好,可继续用于之后的各项研究。第二章肌腱钙化进行性发展并影响肌腱生物力学强度目的：对肌腱钙化定性,明确其是否为进展性疾病,并明确肌腱钙化是否影响肌腱生物力学强度。方法：采用C57小鼠,麻醉后在无菌条件下在右后跟处皮肤做一约1厘米的纵向切口,暴露肌膜及跟腱。在跟腱中段横断跖肌腱及跟腱,缝合皮肤。术后放回笼中自由活动。术后10周及6个月时处死小鼠行小动物CT检测钙化体积并行生物力学测试。同时行HE及阿尔新蓝染色明确组织学变化。结果：心T结果显示术后10周及6个月时,手术侧肌腱均发生肌腱钙化,钙化位于肌腱的骨-腱结合侧及肌腱-肌肉结合处。通过SCANCO VIV040CT系统自带软件对钙化的体积进行定量分析后表明6个月时肌腱钙化的体积大于10周时的钙化体积,差异具有统计学意义差异具有统计学意义(10周：0.0166±0.0086mm3;6个月：0.0459±0.0103 mm3)(均数±标准差)(t=-6.92)(P<0.0001)(n=10)。采用宾夕法尼亚大学定制的激光仪测量肌腱的横截面积,结果显示术后1 0周及6个月时手术侧肌腱的横截面积差异不具有统计学意义(10周：0.4904±0.3393mm3；6个月：0.0459±0.0103 mm3)(均数±标准差)(t=-1.422)(P=0.172)(n=10)。通过偏振光仪我们对正常肌腱、术后10周及6个月的肌腱的纤维排列情况进行分析,结果表明术后6个月时肌腱纤维排列较10周时更加紊乱,差异具有统计学意义(10周：0.0070±0.0186 rad2；6个月：0.0116±0.0416 rad2)(均数±标准差)(t=-2.668)(P=0.021)(n=10)。同时,我们比较了术后10周及6个月时肌腱的生物力学强度,指标包括：肌腱全长模量、肌腱中段模量、最大负荷及最大应力。结果显示术后10周及6个月时肌腱全长模量差异不具有统计学意义(10周：132.4279±55.7405 MPa；6个月：111.8865±72.4591 MPa)(均数±标准差)(t=0.686)(P=0.502)(n=10)。而术后6个月时肌腱中段模型(10周：235.9051±142.0145 MPa；6个月：87.5630±72.2430 MPa)(均数±标准差)(t=2.793)(P=0.016)(n=10)、最大负荷(10周：10.4169±2.9778MPa；6个月：6.6700±2.9948 MPa)(均数±标准差)(t=2.806)(P=0.012)(n=10)及最大应力(10周：23.6418±8.0001 N；6个月：12.1465±9.5536 N)(均数±标准差)(t=-2.825)(P=0.012)(n=10)显著低于术后10周统计学差异显著。术后10周及六个月时在肌腱的骨-腱结合处均发现了骨化组织,在骨化区周围伴有大量软骨样细胞且可以被阿尔新蓝阳染。在肌肉-肌腱结合侧我们发现类似现象。小结：通过观察造模后10周及6个月小鼠的钙化体积及生物力学变化,我们发现肌腱钙化为进展性疾病且损害肌腱生物力学强度,未来探索预防肌腱钙化的药物尤为必要。第三章损伤源性肌腱祖细胞的提取及相关研究目的：明确肌腱损伤后参与肌腱钙化发生的干/祖细胞,为预防肌腱钙化提供新的细胞水平治疗靶点。方法：将小鼠行跟腱切断后1周安乐死后取其跟腱,将肌腱充分切碎,加入肌腱消化液,置于37℃水浴中震荡消化1小时。将分离下来的细胞接种到100mm培养皿中,培养后对细胞进行培养,观察克隆形成,进行干细胞鉴定并行多能分化诱导。将小鼠安乐死后取其跟腱,消化后提取肌腱干/祖细胞,并行与上述损伤肌腱相同处理。结果：原代培养10天后,我们对克隆形成数进行计数,结果发现从正常肌腱及损伤后肌腱中提取的细胞均可以形成克隆。但从损伤后肌腱中提取的细胞克隆形成数量明显多于正常肌腱,差异具有统计学意义(正常肌腱：0.1486±0.0525X 103；损伤肌腱：1.6580±0.1668×103)(均数±标准差)(t=-24.862)(P<0.0001)(n=6)。同时原代培养10天后我们对培养皿中的细胞进行计数,结果显示从损伤后肌腱中提取的细胞数量明显多于正常肌腱,差异具有统计学意义(正常肌腱：0.1073±0.0250X 105；损伤肌腱：1.1150±0.0967 X 105)(均数±标准差)(t=-19.302)(P<0.0001)(n=6)。。从正常肌腱及损伤后肌腱中提取的细胞表面抗原干细胞标志Sca1、CD29、 CD44、CD49e均呈强阳性,而造血系标志CD45、CDllb、Grl呈阴性,从而排除了造血细胞及上皮细胞污染的可能性,证明从正常肌腱及损伤后肌腱中提取的细胞属于干细胞。行成骨、成软骨、成脂及成肌腱诱导后证实损伤源性肌腱祖细胞可成骨、成软骨、成脂及成肌腱分化。成软骨培养体系中我们发现损伤源性肌腱祖细胞较肌腱干/祖细胞及骨髓基质干细胞具有更强的成软骨能力(阿尔新兰阳性染色相对值：骨髓基质干细胞0.9898±0.0356；肌腱干/祖细胞1.9232±0.1017；损伤源性肌腱祖细胞5.4304±0.2033)(均数±标准差)(F=1553.696)(P<0.0001)(n=5)。此外,我们在成软骨培养体系中比较了肌腱干/祖细胞及损伤源性肌腱祖细胞的成软骨标志物的表达。结果显示,损伤源性肌腱祖细胞Agg(肌腱干/祖细胞：0.9678±0.0548；损伤源性肌腱祖细胞：3.3875±0.2436)(均数±标准差)(t=-19.38) (P<0.0001) (n=4)、Col2(肌腱干/祖细胞：1.0010±0.0948；损伤源性肌腱祖细胞：2.2893±0.1480)(均数±标准差)(t-14.663)(P<0.0001)(n=4)及Sox9(肌腱干/祖细胞：0.9643±0.0575；损伤源性肌腱祖细胞：1.4970+0.1316)(均数±标准差)(t=-7.421) (P<0.0001) (n=4)的表达显著高于肌腱干/祖细胞。小结：本研究中我们采用跟腱切断诱导的肌腱钙化模型进行研究,在肌腱损伤后1周提取新生肌腱的局部细胞。我们的结果表明：肌腱损伤后,局部含有一种独特的细胞群,体外培养发现这种细胞表现出克隆形成能力、自我更新及多向分化潜能等干细胞的普遍特性,并表达干细胞表面抗原。我们将这一独特的损伤后肌腱来源的细胞群命名为损伤源性肌腱祖细胞。损伤源性肌腱祖细胞的发现为今后探索肌腱钙化的发生机制及探索新的治疗方式提供了细胞水平靶点。第四章以损伤源性肌腱祖细胞为治疗靶点的药物探索目的：以损伤源性肌腱祖细胞为细胞水平靶点,探索潜在的可以抑制肌腱钙化的药物。方法：将小鼠行安乐死后取其跟腱,将肌腱充分切碎,加入肌腱消化液,置于37-C水浴中震荡消化1小时。将分离下来的细胞接种到100mm培养皿中,培养后至P3代。成骨及成软骨培养体系下评价LDN-1931 89.RAR-γ agonist. GANT 58及塞来昔布对损伤源性肌腱祖细胞成骨及成软骨分化的影响。结果：成软骨培养体系中,LDN-193189.RAR-γ agonist.GANT 58及塞来昔布均显著降低阿尔新蓝阳性染色浓度(Control:1.0455±0.0469:LDN-193189: 0.2628±0.0411；RAR-γ agonist:0.3461±0.0364；GANT58:0.5378±0.0402；塞来昔布：0.7117±0.0199)(均数±标准差)(F=338.262)(P<0.0001)(n=4).此外,我们在成软骨培养体系中比较了LDN-193189、RAR-γ agonist.GANT 58及塞来昔布对损伤源性肌腱祖细胞成软骨标志物表达的影响。结果显示四种药物均显著抑制损伤源性肌腱祖细胞Agg(Control:1.0523±0.0553:LDN-193189: 0.2899±0.0468；RAR-γ agonist:0.2763±0.0348；GANT 58:0.3205±0.1043；塞来昔布：0.4441+0.0568)(均数±标准差)(F=104.937)(P<0.0001)(n=4). Col2(Control:1.1597±0.5931；LDN-193189:0.8258±0.0284；RAR-γ agonist: 0.3606±0.0391；GANT 58:0.7399±0.0340；塞来昔布：0.8217±0.0269)(均数±标准差)(F=210.482)(P<0.0001)(n=4)及Sox9(Control:1.1028±0.0287: LDN-193189:0.8035±0.0225；RAR-γ agonist:0.5497±0.0397；GANT 58: 0.6597±0.0309;塞来昔布：0.7465±0.0303)(均数±标准差)(F=181.153)(P<0.0001)(n=4)的表达。这一结果提示四种药物均可抑制损伤源性肌腱祖细胞成软骨分化。成骨培养体系中,LDN-193189、RAR-γ agonist、GANT 58及塞来昔布均显著降低茜素红阳性染色浓度(Control:1.0192±0.1291: LDN-193189:0.2832±0.0498:RAR-γ agonist:0.2654±0.0347:GANT 58:0.4492±0.0505；塞来昔布：0.0668±0.0275)(均数±标准差)(F=139.279)(P<0.0001)(n=4)。此外,我们在成骨培养体系中比较了LDN-193189、RAR-γ agonist、GANT 58及塞来昔布对损伤源性肌腱祖细胞成骨标志物表达的影响。结果显示四种药物均显著抑制损伤源性肌腱祖细胞Runx2(Control:1.0935± 0.0307；LDN-193189:0.8530±0.0333；RAR-γ agonist:0.5683±0.0423；GANT 58:0.7563±0.0190;塞来昔布：0.7776±0.0319)(均数±标准差)(F=138.481)(P<0.0001)(n=4)及Osx(Control:1.0092±0.0496:LDN-193189:0.3912 ±0.0247；RAR-γ agonist:0.3290±0.0077；GANT 58:0.8287±0.0396；塞来昔布：0.6871±0.0268)(均数±标准差)(F=306.827)(P<0.0001)(n=4)的表达。小结：本研究以损伤源性肌腱祖细胞为细胞水平靶点,进行了大量药物的尝试,试图发现潜在的可以抑制肌腱钙化的药物。本部分结果表明：LDN-193189、RAR-γagonist、GANT 58及塞来昔布均显著抑制损伤源性肌腱祖细胞的成骨及成软骨分化,从而提示上述四种药物可能为抑制肌腱钙化的潜在药物。第五章体内评价抑制肌腱钙化的相关药物目的：采用跟腱切断诱导的肌腱钙化模型来评价相关药物预防肌腱钙化的有效性。方法：采用C57小鼠,麻醉后在无菌条件下在右后跟处皮肤做一约1厘米的纵向切口,暴露肌膜及跟腱。在跟腱中段横断跖肌腱及跟腱,缝合皮肤。术后放回笼中自由活动。术后予LDN-193189、NRX 204647、GANT 58及塞来昔布预防肌腱钙化。术后10周处死小鼠行小动物CT检测钙化体积并于术后3周提取RNA评价药物用于损伤肌腱的安全性。结果：术后10周μCT结果显示：LDN-193189(P<0.0001)(n=5)、GANT 58(P<0.0001)(n=5)及Celecoxib(P<0.0001)(n=5)均显著降低肌腱钙化的体积,RAR-γ agonist组肌腱钙化体积与对照组相比差异不显著(P=0.999)(n=5)(钙化体积：Control:0.3763±0.1239 mm3:LDN-193189:0.0840±0.0095 mm3； RAR-γ agonist:0.3856±0.1020 mm3:GANT 58:0.0250±0.0066 mm3；塞来昔布：0.0197±0.0122 mm3)(均数±标准差)。术后2周发现RAR-γ agonist治疗组肌腱局部红肿,提示RAR-γagonist诱发炎症反应。术后3周行荧光定量PCR对各组Coll基因表达进行比较,结果显示：LDN-193189(P<0.0001)(n=5). RAR-γ agonist(P<0.0001)(n=5)及GANT 58(P<0.0001)(n=5)均显著降低损伤肌腱的Coll表达,Celecoxib组(P=0.204)(n=5)损伤肌腱的Coll基因表达与对照组相比差异不具有统计学意义(Control:1.2139±0.1514;LDN-193189: 0.2361±0.0313；RAR-γ agonist:0.5219±0.0342；GANT 58:0.7019±0.0451；塞来昔布：1.1134±0.0856)(均数±标准差)。术后3周行荧光定量PCR对各组C013基因表达进行比较,结果显示：RAR-γ agonist(P<0.0001)(n=5)及GANT58(P<0.0001)(n=5)均显著降低损伤肌腱的Col 1表达,LDN-193189(P=0.438)(n=5)及Celecoxib组(P=-0.632)(n=5)损伤肌腱的Coll基因表达与对照组相比差异不具有统计学意义(Control:1.1958±0.1187;LDN-193189:0.2361 ±0.0313；RAR-γagonist:0.5219±0.0342;GANT 58:0.6384±0.0689；塞来昔布：1.1110±0.1772)(均数±标准差)。术后3周行荧光定量PCR对各组Scx基因表达进行比较,结果显示：LDN-193189(P<0.0001)(n=5).RAR-γ agonist (P<0.0001)(n=5)及GANT 58(P<0.0001)(n=5)均显著降低损伤肌腱的Scx表达,Celecoxib组(P=0.639)(n=5)损伤肌腱的Scx基因表达与对照组相比差异不具有统计学意义(Control:1.1136±0.0484:LDN-193189:0.3263±0.0273； RAR-γ agonist:0.5304±0.0271；GANT 58:0.3799±0.2982；塞来昔布：1.0852±0.0589)(均数±标准差)。术后3周行荧光定量PCR对各组Tnmd基因表达进行比较,结果显示：LDN-193189(P<0.0001)(n=5).RAR-γagonist(P<0.0001)(n=5)及GANT 58(P<0.0001)(n=5)均显著降低损伤肌腱的Tnmd表达,Celecoxib组(P=0.796)(n=5)损伤肌腱的Tnmd基因表达与对照组相比差异不具有统计学意义(Control:1.1609±0.6440；LDN-193189:0.4636±0.0418:RAR-γ agonist:0.5446±0.0407；GANT 58:0.4083±0.0208；塞来昔布：1.1248±0.1158)(均数±标准差)。小结：本部分研究通过肌腱切断诱导的肌腱钙化模型评价LDN-193189、 NRX 204647、GANT58及塞来昔布四种药物在预防肌腱钙化中的作用。我们的结果表明LDN-193189、GANT 58及塞来昔布均可有效抑制肌腱钙化的发生。我们进一步比较各组肌腱相关基因表达,结果提示LDN-193189及GANT 58可能影响肌腱的修复过程。因此,塞来昔布为抑制肌腱钙化最为安全有效的药物。第六章塞来昔布抑制肌腱钙化的最佳治疗时程目的：本研究中我们将对塞来昔布抑制肌腱钙化的最佳治疗时程做一系统评估,探索保证其有效前提下的最短治疗时程。方法：采用C57小鼠,麻醉后在无菌条件下在右后跟处皮肤做一约1厘米的纵向切口,暴露肌膜及跟腱。在跟腱中段横断跖肌腱及跟腱,缝合皮肤。术后放回笼中自由活动。术后予塞来昔布2周、6周及10周预防肌腱钙化。术后10周处死小鼠行小动物CT检测钙化体积比较各组差异。结果：术后10周μCT结果显示：与对照组相比,Celecoxib 0-6周组(P<0.0001)(n=5)及Celecoxib 0-10周组(P<0.0001)(n=5)均显著降低肌腱钙化的体积,Celecoxib 0-2周组(P=0.459)(n=5)肌腱钙化体积与对照组相比差异不具有统计学意义(钙化体积：Control:0.3969±0.1209mm3; Celecoxib 0-2:0.3279±0.1202 mm3; Celecoxib 0-6:0.0149±0.0071 mm3; Celecoxib 0-10: 0.0197±0.0122 mm3)(均数±标准差)。小结：本研究采用肌腱切断诱导的肌腱钙化模型,比较塞来昔布不同治疗时程抑制肌腱钙化的疗效。结果表明：中长期塞来昔布给药可有效抑制肌腱钙化的发生。