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哺乳动物的卵母细胞在减数分裂过程中产生的第一极体(The first Polar Body,以下简称PbI)和第二极体(The second Polar Body,下简称PblI)在正常情况下并不参与胚胎的发育而逐渐退化。因此许多学者误认为极体是完全没有功能的小细胞。然而,Feng等 (1997),Wakayama等(1997、1998)的研究结果证实:将PbI注入去核卵母细胞后再注入精子头部可以产生具有生殖功能的小鼠后代。同时,国内学者对这一问题也开始逐渐有所认识,但至今仍没有确切的研究结果报道。确立此课题的目的是通过验证和评价PbI的生殖功能潜力,为进一步开展其他动物卵母细胞PbI相关研究奠定理论与技术基础。
本研究以昆明系和ICR系小鼠为研究对象,首先通过人为干预其排卵时间的手段解决如何得到数量充足和具有高生物活性PbI的问题;再通过生物化学的方法从卵母细胞中分离出PbI,进而对其进行保存条件研究。并采用细胞工程手段将获得的PbI染色体组重组入卵母细胞中,观察其是否具有生殖功能。
1、小鼠第一极体的获取及保存条件研究
用孕马血清(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)对6~8周龄的雌性昆明系及ICR系小鼠进行超数排卵处理,从注射hCG后10h起每隔2h采集一组小鼠的卵丘卵母细胞复合体(COCs),对卵母细胞内的PbI的数量和形态进行统计,并用台盼蓝染色法鉴定第一极体的活性;同时对新获取的卵丘卵母细胞复合体进行不同温度条件的保存实验。结果表明,在注射hCO后12-14h所获得卵母细胞内的PbI活性最高;在室温和37℃下,卵丘卵母细胞复合体内的PbI活性很快便完全丧失,而在4℃条件下保存,经过48h后其活性依然良好。
2、小鼠卵母细胞与PbI的分离
将包含有PbI的卵母细胞移入链霉蛋白酶溶液中在室温(25℃)下作用30s,然后迅速移入M2液中,用直径150-200 μm的玻璃微管反复柔和吹吸卵母细胞,直到透明带完全破裂,PbI即可与卵细胞完全分离,然后再将单个的PbI拾获,放入微滴培养系统中培养。
3、PbI重组卵母细胞研究
利用显微操作技术将昆明系小鼠PbI的内容物取出并迅速注射入经去核处理的同种卵母细胞中,在M2培养液中培养2h后使其与精子发生体外受精作用,然后再转入M16培养液中培养,观察发育状况。同时用C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)C14-Y01-FMl310sb系小鼠和C57BL/6J系小鼠为参照实施同样的操作流程进行验证。结果昆明系小鼠117枚重组卵母细胞中有13枚发育到2-细胞胚胎;C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)C14-Y0l-FMl310sb系小鼠和C57BL/6J系小鼠38枚重组卵母细胞中有3枚发育到2-细胞胚胎。