Il-8及Il-8R抗体抑制雄激素非依赖性前列腺癌细胞增殖和迁移的研究

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目的:  本课题首先通过实验验证DU145细胞能高表达IL-8;然后,进一步采用流式细胞术、MTT法、Transwell试验及免疫荧光实验探讨IL-8抗体和IL-8R抗体能加速DU145细胞凋亡,并抑制其增殖和迁移,为临床应用IL-8抗体和IL-8R抗体治疗雄激素非依赖性PCa提供新的靶点和理论依据。  方法:  1.DU145细胞培养上清IL-8水平的检测:分别取DU145细胞培养0h、12h、24h和48h上清500ul,分为0h组(即为对照组)、12h组、24h组和48h组四个组,采用IL-8ELISA检测试剂盒,检测不同培养时间培养上清IL-8含量。  2.流式细胞术检测DU145细胞凋亡:选取DU145细胞铺板,每孔1ml,细胞浓度5×105/ml,分别加入IL-8抗体,IL-8R抗体及加入等量培养基作为对照组,即anti-IL-8组、anti-IL-8R组和Control组。24h后分别检测三组肿瘤细胞凋亡情况。  3.MTT法检测DU145细胞增殖活性:应用MTT法分别检测anti-IL-8组、anti-IL-8R组和Control组肿瘤细胞增殖情况。  4.Transwell试验检测DU145细胞迁移能力:应用Transwell试验分别检测anti-IL-8组、anti-IL-8R组和Control组肿瘤细胞穿过生物膜形成克隆数多少。  5.免疫荧光结核激光共聚焦显微镜检测DU145细胞HMGB1蛋白表达:应用免疫荧光结核激光共聚焦显微镜检测分别检测anti-IL-8组、anti-IL-8R组和Control组肿瘤细胞HMGB1蛋白表达量。  6.统计学方法:计量数据以均数加减标准差((x)±s)表示,两组间差异比较采用t检验。检验水准α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。  结果:  1.酶联免疫法ELISA检测IL-8浓度:0h组、12h组、24h组和48h组DU145细胞培养上清IL-8浓度分别为(0.03±0.02)ng/ml、(1.21±0.05)ng/ml、(3.10±0.05)ng/ml、(3.91±0.06)ng/ml。各组之间均有统计学差异(均有P<0.001)。  2.流式细胞术检测DU145细胞凋亡率:结果显示与空白对照组相比,DU145细胞经IL-8/IL-8R刺激后凋亡率分别为(9.92±1.02)%和(10.34±1.07)%,均比空白对照组(1.60±0.37)%,且有统计学差异(T=21.2,P<0.001;T=12.5,P<0.001)。  3.MTT法检测DU145细胞增殖活性:加入IL-8抗体和IL-8R抗体后DU145细胞克隆形成减少,分别为(1.31±0.10)和(1.07±0.14),两组OD值均显著低于空白对照组(3.02±0.08),且有统计学差异(T=9.3,P<0.001;T=5.4,P<0.001)。  4.Transwell检测DU145细胞迁移能力:加入IL-8抗体组或IL-8R抗体组细胞穿过生物膜形成克隆数分别为(49.67±3.54)个、(49.83±3.44)个,均低于未加抗体的空白对照组克隆个数(164.83±4.63)个,且有统计学差异(T=19.3,P<0.001;T=9.3,P<0.001)。  5.免疫荧光检测DU145细胞HMGB1蛋白表达:未加抗体的空白对照组细胞呈现梭形较多,胞质丰富,HMGB1表现为红色大颗粒状或小块状。而加入IL-8/IL-8R抗体后,细胞多呈现圆形,胞质减少,HMGB1表达信号弱,仅呈现微粒状或粉尘状。  结论:  1.培养雄激素非依赖性前列腺癌DU145细胞时细胞可分泌IL-8,且随时间延长,分泌量增加。  2.IL-8抗体和IL-8R抗体可在体外条件下促进DU145细胞凋亡,并抑制该肿瘤细胞增殖和迁移。
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