研究背景和目的转移是肝细胞癌(HCC)治愈性切除后患者复发率高和生存率差的主要原因,也是影响HCC癌患者预后的最主要的因素之一。包括肝细胞癌在内的肿瘤转移机制研究一直是肿瘤研究领域的热点和难点。目前较为公认的肿瘤转移级联步骤主要包括到肿瘤上皮间质转换(EMT)、肿瘤侵入周围血管进入循环系统、穿出血管壁进入转移靶器官的周围实质并定植。其中的EMT过程是肿瘤转移的重要起始步骤,伴随着EMT变化的是肿瘤细胞运动能力和对周围组织侵袭及降解周围基质能力的增强。在过往的研究中一些驱动EMT发生的经典的转录因子如Snail1,Slug,Zeb1等被陆续发现和报道,另外其他一些非经典的转录因子也被证实在EMT或肿瘤转移中发挥重要作用。转录因子是一类在几乎所有生物学过程中都发挥重要作用的细胞内功能分子,其在肿瘤的发生和进展中也发挥着极其关键的作用。而Sox和Fox转录因子家族就是其中功能十分重要的两大转录因子家族。我们在前期的研究中发现Sox转录因子家族中的Sox12在HCC临床标本中呈现较Sox其他家族成员更显著的高表达,初步的临床预后分析和功能研究也表明Sox12可能在HCC转移中发挥作用。另外我们在研究Fox Q1在HCC转移中的分子机制时发现Fox Q1可能对Sox12的表达存在转录调控关系。基于上述事实和既往的研究结果,我们提出Sox12可能在HCC转移中发挥重要作用,拟对其相关分子机制进行系统研究,并通过较大规模临床样本验证Sox12和其相关分子的临床意义。方法1.Western blot检测Sox12在具有不同转移能力的HCC细胞系中的表达,验证Sox12过表达和sh Sox12表达慢病毒的过表达或敲低效率,分析Sox12表达调控对EMT标志物、下游调控分子Twist1和FGFBP1表达的影响。进行实时定量PCR来评估Sox12在HCC组织中的表达,并与邻近的非肿瘤组织和正常肝组织相比较,分析Sox12表达调控对Twist1和FGFBP1表达、Fox Q1表达调控对Sox12表达的影响。免疫荧光染色检测Sox12表达调控对EMT标志物在HCC细胞中表达的影响。2.功能性缺失和功能获得性体外和体内实验(Transwell细胞迁移和侵袭实验,裸鼠尾静脉和原位瘤转移实验)研究或证实Sox12,Twist1,FGFBP1在HCC转移中的作用。3.使用生物信息学预测来鉴定Fox Q1或Sox12在Sox12或Twist1,FGFBP1的启动子区域的潜在结合位点。进行了包括荧光素酶报告基因和Ch IP实验以验证上述转录激活关系和及具体的Fox Q1或Sox12的结合位点。4.免疫组织化学检测评估Sox12,Twist1,FGFBP1和Fox Q1的临床意义。结果1.与邻近的非肿瘤组织和正常肝组织相比,HCC组织中Sox12的m RNA表达水平显著升高。HCC术后出现复发的患者(120个中的68个)比没有出现术后复发的患者具有更高的Sox12 m RNA表达(120中52个);发生转移的HCC患者的原发灶HCC组织中的Sox12 m RNA表达显著高于未发生转移患者的HCC组织。同样实时定量PCR分析显示转移灶HCC组织中的Sox12 m RNA表达高于原发灶HCC组织,免疫组织化学染色结果也显示转移灶HCC样本中Sox12表达要高于原发灶HCC样本。我们进一步使用免疫组织化学染色分析了含690例HCC患者(队列I)的组织微阵列中的Sox12蛋白表达,结果显示Sox12在HCC组织中表达较邻近的非肿瘤组织表达显著升高,且Sox12表达主要定位于细胞核。分析结果显示Sox12的阳性表达与肿瘤包膜消失、微血管浸润和更高的TNM分期显著相关。与Sox12表达阴性的患者相比,Sox12表达阳性的患者其总生存时间更短,复发率也更高。多变量分析显示Sox12阳性表达是术后复发和生存率降低的独立和显著危险因素。2.免疫印迹结果显示高转移性肝癌细胞系中Sox12的表达显著高于低转移潜能的HCC细胞系。体外Transwell实验显示Sox12表达的上调增加了Huh7细胞的迁移和侵袭潜力,而Sox12的下调则相应降低了HCCLM3细胞的迁移和侵袭潜力。体内转移实验也证实Sox12的上调增加了肺转移的发生率和转移性肺结节的数量,同时缩短了裸鼠的总体存活时间;而Sox12的下调则降低了肺转移的发生率和转移性肺结节的数量,同时延长了裸鼠总体存活时间。MTT和平板克隆形成实验显示Sox12的上调加速了Huh7和SMMC7721细胞的增殖,而Sox12的下调则减缓了HCCLM3和MHCC97H细胞的增殖。软琼脂克隆形成实验同样表明Sox12的过表达能增强Huh7和SMMC7721细胞在软琼脂中的贴壁非依赖性生长,而敲减Sox12则降低软琼脂中HCCLM3和MHCC97H细胞的贴壁非依赖性生长。体内成瘤实验也显示Sox12的上调促进了Huh7细胞的肿瘤生长,而Sox12的下调减弱了HCCLM3细胞的肿瘤生长。而Annexin V/PI流式凋亡分析显示Sox12对HCC细胞的凋亡没有明显作用。3.免疫荧光显示,Sox12的上调减弱了Huh7细胞膜E-cadherin的表达并增加了细胞浆Vimentin的表达,而Sox12的下调则增加了HCCLM3细胞膜上E-cadherin并减弱了Vimentin的表达。蛋白质免疫印迹实验显示Sox12的上调能诱导上皮标志物(E-cadherin和ZO-1)的表达下降并引起间质标志物(Vimentin和Fibronectin)的表达增加;相反Sox12的下调显著增加了上皮标志物的表达并降低间质标志物的表达。然后使用EMT相关实时定量PCR微阵列比较Huh7-Sox12和Huh7-control细胞之间的m RNA表达谱的差别。结果显示Sox12的上调增加了一些转移相关基因的表达,其中包括FGFBP1,TWIST1,JAG1,MST1R,ZEB2,VIM,MMP9,ERBB3,FN1,ITGA5和ZEB1。其中FGFBP1和Twist1是Sox12过表达引起变化最显著的上调基因。免疫印迹和实时定量PCR证实Sox12的上调和下调分别引起Twist1表达的显著下调和上调。进一步的免疫印迹实验显示Twist1的表达下调挽救了由Sox12过表达诱导的E-cadherin表达降低,而Twist1的上调则显著抑制了由Sox12敲低诱导的E-cadherin表达增加。萤光素酶报告基因检测同样显示Sox12的表达转录激活Twist1启动子活性。序列分析揭示Twist1启动子区域存在三个潜在的Sox12结合位点。截短突变和定点诱变表明第二个和第三个Sox12结合位点对于Sox12诱导的Twist1转录激活是关键的。Ch IP分析也证实Sox12与HCC细胞和人类HCC组织中的Twist1启动子区域直接结合。考虑到Twist1在侵袭和转移中的重要作用,我们想进一步确定Twist1是否参与Sox12介导的HCC转移。Twist1的下调显著降低了Sox12增强的细胞迁移和侵袭,而Twist1的上调拯救了由Sox12敲低引起的细胞迁移和侵袭力降低。体内转移实验显示Twist1的下调降低了肺转移的发生率和转移性肺结节的数量,同时增加裸鼠的总体存活时间。相反,Twist1的上调拯救了肺转移的发生率和转移性肺结节的数量,同时缩短了裸鼠的总体存活时间。4.用同样的方法我们证实Sox12的上调增加了HCC细胞中FGFBP1的表达,而Sox12的下调则降低了FGFBP1的表达。萤光素酶报告基因实验显示Sox12能转录激活FGFBP1启动子活性。序列分析揭示了FGFBP1启动子存在两个潜在的Sox12结合位点。截短突变和定点突变变表明Sox12的两个结合位点对于Sox12诱导的FGFBP1转录激活都是关键的。Ch IP分析进一步证实Sox12在HCC细胞和人类HCC组织中能直接结合到FGFBP1启动子相应区域上。为了验证FGFBP1是否参与Sox12介导的转移,我们稳定地下调了Huh7-Sox12细胞中的FGFBP1表达,并且上调了HCCLM3-sh Sox12细胞中的FGFBP1表达。体外迁移和侵袭实验表明FGFBP1的下调显著降低了Sox12增强的细胞迁移和侵袭,而FGFBP1的上调拯救了由Sox12敲低引起的细胞迁移和侵袭力减弱。体内转移实验还证实FGFBP1的下调降低了Huh7-Sox12组肺转移的发生率和转移性肺结节的数量,同时延长了裸鼠的总体存活时间。相反FGFBP1的上调拯救了HCCLM3-sh Sox12组肺转移的发生率和转移性肺结节的数量,同时缩短了裸鼠总体存活时间。5.我们进一步评估了人类HCC组织(组群I)中Sox12与Twist1或FGFBP1表达之间可能的表达相关性。免疫组织化学染色结果显示FGFBP1的表达在肝癌组织中比相邻的非肿瘤组织中显著上调。FGFBP1的过表达与较差的肿瘤分化和较高的TNM分期等显著相关。另外FGFBP1阳性表达的HCC患者总生存期较阴性HCC患者更短、复发率也更高。Twist1的阳性表达也与HCC患者不良预后和侵袭性肿瘤行为等有关。免疫组化结果显示Sox12表达与队列I HCC组织中的FGFBP1和Twist1表达呈显著正相关。Kaplan-Meier分析显示Sox12/FGFBP1和Sox12/Twist1阳性共表达的患者复发率更高,总生存时间也更短。Sox12,Twist1和FGFBP1的表达相关性和预后价值在另一个独立队列的HCC患者(队列II)中通过免疫组织化学染色同样得到验证。结果显示FGFBP1和Twist1的阳性表达分别与不良预后和侵袭性肿瘤行为有关。Sox12的表达分别与队列II HCC组织中Twist1和FGFBP1的表达呈正相关。Sox12/Twist1和Sox12/FGFBP1阳性共表达的患者复发率最高,总生存时间最短。6.生物信息学分析显示在Sox12启动子区域存在出四个潜在的Fox Q1结合位点。蛋白质印迹显示Fox Q1的上调能增加Sox12的表达,而Fox Q1的下调则降低了HCC细胞中的Sox12的表达。萤光素酶报告基因检测证实Fox Q1能转录激活Sox12启动子活性。截短突变和定点突变实验显示第三个和第四个Fox Q1结合位点对于Fox Q1诱导的Sox12转录激活是关键的。Ch IP分析进一步证实Fox Q1可直接与HCC细胞和人类HCC组织中的Sox12启动子区域结合。体外Transwell实验表明Sox12的下调减弱了Fox Q1增强的细胞迁移和侵袭能力,而Sox12的上调则拯救了敲低Fox Q1引起的迁移和侵袭力减弱。体内转移实验表明Sox12的下调降低了SMMC7721-Fox Q1组肺转移的发生率和转移性肺结节的数量,同时延长了裸鼠的总体存活时间。相反Sox12的上调拯救了HCCLM3-sh Fox Q1肺转移的发生率和转移性肺结节的数量,同时延长了裸鼠的总体存活时间。此外,队列I的HCC组织的免疫组化染色结果分析显示Fox Q1表达与Sox12表达呈正相关。Kaplan-Meier分析显示Fox Q1和Sox12阳性共表达的患者复发率最高、总生存时间也最短。免疫组化染色结果分析显示队列II HCC组织中Fox Q1表达与Sox12表达也呈正相关,Fox Q1和Sox12共阳性表达的患者预后较其他表达模式的HCC患者更差。结论1.Sox12在肝细胞癌组织中表达升高且与肝细胞癌预后不良和肿瘤侵袭性行为相关;2.Sox12通过转录激活Twist1和FGFBP1的表达促进了肝细胞癌转移;3.Sox12在Fox Q1介导肝细胞癌转移中发挥重要作用;4.Twist1,FGFBP1,Fox Q1阳性表达或与Sox12阳性共表达与肝细胞癌预后不良和肿瘤侵袭性行为相关。