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苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)和家蚕核型多角体病毒(BmNPV),是重要的模式杆状病毒,关于它们的复制机制的研究,一直吸引着国内外研究者的目光。在真核生物DNA复制过程中,PCNA能够提高DNA聚合酶δ的持续合成能力,是一个关键辅助因子。经PCNA的生物系统发育树分析发现,仅有9种杆状病毒可以编码自身的PCNA,但它们的具体功能却不为人知。AcMNPV的基因组能编码一种类似增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)的蛋白,其命名为AcPCNA。在瞬时复制实验中却发现AcPCNA不是AcMNPV DNA复制所必需的因子。为了进一步揭示AcPCNA的功能,本实验根据GenBank中提供的AcMNPV的PCNA基因序列,成功构建重组原核表达质粒pET30a-AcPCNA,经IPTG诱导表达,Western Blot成功检测到目的蛋白。经Ni-NTA柱浓度梯度洗脱和Mono Q离子交换层析柱纯化得到大量的His-AcPCNA,利用SuperoseTM6分子筛推测在非变性条件下的AcPCNA的分子量约为100 kDa,而预测分子量为30.7kDa,说明AcPCNA很可能是以三聚体的形式表达装配。纯化的AcPCNA超滤浓缩后与CNBr-activated Sepharose 4B耦联制备亲和层析柱,收集野生型(wild type,wt)AcMNPV感染的Sf-9细胞,超声裂解,低温高速离心后,得到的总蛋白液通过AcPCNA耦联亲和层析柱,洗脱馏分经质谱鉴定总共查找到12种可能与AcPCNA的存在互作的蛋白。其中包括Sf-9细胞与核糖体组成以及蛋白合成相关的Ribosomal protein L3和Actin等蛋白,还包括AcMNPV的LEF3、p48 protein等蛋白。亲和层析与质谱联用查找AcPCNA的互作蛋白,对于了解病毒的DNA修复机制非常有意义。为进一步研究和改造杆状病毒奠定了重要的生物学基础,也为生物防治研究生产新型生物杀虫剂提供理论支持,从而提高农作物经济效益。本实验还成功构建了供体质粒pFastBacHTb-Ac PCNA,利用MultiBac杆状病毒表达系统获得重组Bacmid,转染Sf-9细胞制备重组病毒,表达获得翻译修饰后的AcPCNA,并通过Poly(dA)/Oligo(dT)酶活分析检测其对BmNPV-POL的聚合酶活性影响,并未发现刺激活性。说明BmNPV-POL表现为AcPCNA非依赖性。由BmNPV ORF53编码的家蚕核型多角体病毒DNA聚合酶(BmNPV-POL)在病毒的复制传代过程中扮演着重要的角色,而国内外对BmNPV-POL的研究较少,无法获得大量高纯度的活性蛋白可能是原因之一。本实验通过设计引物PCR改造已有的pFastBacHTc-BmNPV-POL-His表达载体,将C-端的His标签换成Strep标签,利用Strep Tactin(修饰的链球菌抗生素蛋白)亲和层析柱纯化,经抗Strep多克隆抗体Western Blot检测得到与预测分子量一致的蛋白。通过Poly(dA)/Oligo(dT)酶活分析测定其活性,结果显示有较高酶活性。通过比较改造前后融合蛋白的纯化效果发现,Strep Tactin亲和层析柱一步纯化即可得到大量的高纯度的BmNPV-POL,为后续实验提供充足的研究材料。此方法操作简单,蛋白损失较少,为大量制备BmNPV-POL提供一种新的方法,推进BmNPV-POL的研究发展。