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【背景】膜联蛋白Annexin A1（ANXA1）是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白,参与细胞分化、迁移、增值和凋亡等一系列重要的细胞事件。我们前期研究发现:ANXA1不同的亚细胞定位对缺血再灌注损伤神经元产生截然不同的作用:ANXA1核定位能启动caspase级联反应,诱导神经元凋亡;而其膜定位能促进小胶质细胞释放抗炎介质,保护缺血损伤神经元。因此调控ANXA1亚细胞定位使其趋利避害,减少其核转位的同时增加膜转位,将为脑缺血再灌注损伤患者的治疗和预后带来曙光。S100A11是ANXA1重要的伴侣分子,易与其形成四聚体,S100A11是否是调控ANXA1亚细胞定位的关键分子?调控S100A11的表达能否发挥脑缺血神经保护作用?针对这些科学问题,我们通过体内、体外实验证实了上调S100A11的表达可抑制ANXA1核转位从而减少神经元凋亡,改善缺血后神经功能。本研究初步阐明S100A11是调控ANXA1亚细胞转位的重要调节分子,为缺血性脑中风治疗提供新的治疗手段和药物研发靶点。【目的】本研究旨在探讨S100A11对ANXA1亚细胞定位的影响,逐步寻找S100A11调节ANXA1亚细胞定位的分子机制,提出S100A11对脑缺血再灌注损伤神经元具有保护作用。【方法】小鼠经大脑中动脉栓塞（MCAO）手术模拟在体脑缺血再灌注损伤,采用神经功能评分、水迷宫、转轮实验和旷场实验检测小鼠再灌注损伤后运动和学习记忆能力,采用TTC染色实验检测缺血梗死灶大小。N2a细胞经OGD/R处理模拟体外缺血再灌注损伤,采用TUNEL染色和MTT法检测细胞凋亡及活力,采用Annexin V-FITC-PI染色和流式细胞计数检测细胞凋亡,采用RT-qPCR检测Bid基因mRNA表达水平,采用Western blot实验检测凋亡相关分子表达。分别构建不同结构域的ANXA1和S100A11质粒,应用Co-IP及FRET实验筛选ANXA1与S100A11结合的结构域。【结果】（1）小鼠脑缺血再灌注处理后S100A11表达减少,上调S100A11表达发挥脑缺血再灌注神经保护作用小鼠经MCAO处理后,脑片免疫荧光染色显示S100A11蛋白水平明显下降。小鼠经侧脑室注射重组腺病毒S100A11,给予MCAO手术处理,TTC染色结果显示:上调S100A11后,小鼠梗死灶体积明显缩小,神经功能缺损评分降低。与此同时,TUNEL染色显示:过表达S100A11后,皮层和海马区神经元凋亡减少。过表达S100A11后,水迷宫结果显示小鼠到达平台的潜伏期和游泳距离明显缩短,目标象限停留时间显著增加;旷场实验结果显示过表达S100A11后,小鼠活动的总距离增加,在中央区活动时间延长;转轮实验结果显示过表达S100A11后,小鼠从转轮上掉下来的时间间隔延长。（2）OGD/R处理后,S100A11依赖于ANXA1保护缺血损伤神经元N2a细胞经OGD/R处理后,免疫荧光和蛋白免疫印迹方法结果显示:与对照组相比,OGD/R情况下S100A11表达量减少。Co-IP实验结果显示:S100A11与ANXA1相互作用减少。MTT和Annexin V-FITC-PI检测结果显示:OGD/R+shS100A11与OGD/R组相比,细胞活力明显减弱,细胞凋亡则明显增加;OGD/R+S100A11与OGD/R组相比,细胞活力增加,细胞凋亡明显减少;而OGD/R+ANXA1与OGD/R组相比,细胞活力同样减弱,细胞凋亡明显增加;但是OGD/R+ANXA1+S100A11与OGD/R+ANXA1组相比,细胞活力得到改善,细胞凋亡也相应减少。（3）OGD/R情况下,S100A11抑制ANXA1核转位所诱导凋亡相关分子的表达N2a细胞经OGD/R处理后,RT-qPCR结果显示:过表达S100A11后Bid mRNA表达减少,干扰S100A11后,Bid mRNA表达明显增加。应用Western blot检测tBid、cleaved PARP、cleaved caspase-3蛋白量,结果显示:过表达S100A11后上述凋亡相关蛋白量均减少,而干扰S100A11后均增加。RT-qPCR结果显示:仅仅过表达ANXA1后Bid mRNA表达增加,而同时过表达S100A11后Bid mRNA表达明显减少。应用Western blot方法检测上述凋亡相关蛋白量,结果显示:过表达ANXA1后上述凋亡相关蛋白量均增加;干扰shS100A11后均减少。Annexin V/FITC实验结果显示:干扰S100A11后,凋亡细胞明显增多,但同时给予zDEVD-FMK后,凋亡细胞明显减少;过表达ANXA1后凋亡细胞增加,同时给予zDEVD-FMK后,凋亡细胞明显减少。（4）OGD/R处理后,过表达S100A11抑制ANXA1细胞核转位,增加其细胞膜转位N2a细胞经OGD/R处理后,免疫荧光和Western blot结果显示:OGD/R处理后ANXA1细胞膜、细胞核分布均增多,细胞浆含量减少。上调S100A11表达后,ANXA1细胞膜分布增多,细胞核分布减少。下调S100A11表达后,ANXA1细胞膜分布减少,细胞核分布增加。（5）OGD/R情况下,S100A11主动抑制ANXA1核转位N2a细胞经OGD/R处理后,Co-IP结果显示:PEX14与ANXA1无结合,而PEX14与S100A11结合增加。Western blot结果显示:干扰PEX14后,ANXA1细胞膜分布减少,细胞浆分布增加,细胞核分布无明显变化;过表达S100A11同时干扰PEX14对ANXA1细胞膜分布无明显变化,细胞浆分布增加,细胞核分布减少。而另一方面,仅仅过表达PEX14后,ANXA1细胞膜分布增加,细胞浆分布减少,细胞核分布无明显变化;而同时干扰S100A11后,ANXA1细胞膜、细胞浆、细胞核分布无明显变化。（6）OGD/R情况下,S100A11与ANXA1的核转位信号NTS结合增加N2a细胞经OGD/R处理后,Co-IP结果显示:下调S100A11表达后,ANXA1与importinβ结合增加;上调S100A11后,ANXA1与importinβ结合减少,而S100A11与importinβ无结合。N2a细胞转染ANXA1不同突变体质粒,Co-IP结果显示:ANXA1蛋白N端和C端均能与S100A11结合;而ANXA1-ΔN-ΔNTS不能与S100A11结合。FRET实验结果进一步证实:ANXA1-ΔN和ANXA1-ΔNTS均能与S100A11结合,但ANXA1-ΔN-ΔNTS不能与S100A11结合。（7）S100A11 Leu42-Ile98氨基酸序列直接抑制ANXA1核转位,抑制凋亡分子的表达N2a细胞转染S100A11不同突变体质粒后,Co-IP结果显示:S100A11-（42-98）可以与ANXA1结合。N2a细胞经OGD/R处理后,Western blot结果显示:S100A11-（42-98）可模拟全长S100A11的功能,促进ANXA1膜转位,抑制ANXA1核转位;免疫荧光结果显示一致。RT-qPCR结果显示:S100A11-（42-98）能降低Bid mRNA表达,同时也能抑制过表达ANXA1所引起的Bid mRNA表达。此外,S100A11-（42-98）降低tBid、cleaved PARP和cleaved caspase-3蛋白量,同时也可以降低过表达ANXA1所引起的上述凋亡相关蛋白的表达。TUNEL染色法结果显示,过表达S100A11-（42-98）后OGD/R诱导的细胞凋亡明显减少。【结论】本研究首次探讨S100A11对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用及其分子机制。我们发现S100A11通过与importinβ竞争结合ANXA1的核转位信号NTS序列从而抑制ANXA1的入核,减少Bid基因的表达,进而抑制细胞凋亡通路的活化,最终减少由缺血再灌注损伤所致的神经元凋亡。此外,我们还证明S100A11蛋白Leu42-Ile98位氨基酸序列是与ANXA1结合的关键结构域,且该氨基酸序列能模拟全长S100A11蛋白对脑缺血神经元的保护作用。