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研究背景和研究目的肝脏缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)是肝脏手术和肝移植中最常见、最严重也是最难于治疗的问题,过度的内质网应激又是IRI中极为关键的原因之一。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类具有基因调节功能的内源性非编码小分子RNA,可以通过识别3’-非编码区(3’-uncoding region,3’UTR)与其靶向信使RNA(message RNA,mRNA)相结合,降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译,降低蛋白水平。在占据人类基因组98.5%的非蛋白编码序列中,绝大多数被转录成长度大于200个碱基的所谓“长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)”。LncRNA在多个层面上参与细胞分化和个体发育等重要生命过程的调控,并与人类的重大疾病密切相关。我们的前期研究发现microRNA-199a-5p(miR-199a-5p)可以通过抑制过度内质网应激而发挥肝脏保护作用,并且发现:当肝脏IRI时,长链非编码RNA AK054386(LncRNA AK054386)迅速上调,miRNA-199a-5p成熟体迅速下调而pri-miR-199a-5p初始体的水平不变。通过生物信息学分析,我们认为两者存在着密切联系,但这是否为导致内质网应激失控的机制,正是本研究关注的问题。因此,我们拟利用小鼠肝脏IRI模型和小鼠胚胎肝细胞BCL CL.2缺氧/复氧模型,研究LncRNA AK054386、miR-199a-5p和内质网应激相关分子互相作用关系,明确LncRNA AK054386是如何调控肝细胞持续内质网应激及细胞凋亡的,为肝脏IRI的机制及防治研究开拓新思路并奠定理论基础。为明确相关机制,我们需要关注以下3个方面:1.miR-199a-5p对肝脏IRI的影响及作用;2.LncRNA AK054386对肝脏IRI的影响及作用;3.LncRNA AK054386与miR-199a-5p相互作用的机制。研究方法1.Target Scan,miRanda数据库联合分析预测小鼠肝细胞LncRNA AK054386和miR-199a-5p的结合位点2.建立C57BL/6小鼠肝脏IRI模型;3.Real-time PCR检测小鼠IRI模型中,肝细胞LncRNA AK054386和miR-199a-5p基因转录水平;4.建立小鼠胚胎肝细胞(BNL CL.2细胞)缺氧/复氧模型;5.BNL CL.2细胞系转染LncRNA AK054386过表达质粒、LncRNA AK054386干扰质粒、miR-199a-5p mimics和miR-199a-5p inhibitor,建立相应的对照组;6.流式细胞术检测转染后细胞系在缺氧/复氧过程中的凋亡情况;7.Western blot检测转染后细胞系经缺氧/复氧处理后,内质网应激相关蛋白的表达情况;8.Real-time PCR检测经转染后正常培养条件下的BNL CL.2细胞LncRNA AK054386、miR-199a-5p成熟体和初始体pri-miR-199a-5p的转录水平;9.借助双荧光素酶报告基因载体检测LncRNA AK054386与miR-199a-5p的相互作用情况。结果1.生物信息学分析发现LncRNA AK054386与miR-199a-5p关系密切;2.成功建立小鼠肝脏IRI模型;3.小鼠肝脏IRI模型中,miR-199a-5p水平在缺血时变化不明显,再灌注后明显下调;4.小鼠肝脏IRI模型中,LncRNA AK054386水平在缺血时有所上调,再灌注后显著上调;5.体外成功建立BNL CL.2细胞缺氧/复氧模型;6.miR-199a-5p能够在缺氧/复氧过程中对细胞起到保护作用;7.LncRNA AK054386在缺氧/复氧过程中对细胞不起到直接作用,通过调控miR-199a-5p间接阻断其对细胞的保护作用;8.LncRNA AK054386能够降低miR-199a-5p成熟体的表达,对pri-miR-199a-5p初始体的表达无显著影响;9.双荧光素酶报告基因证实:LncRNA AK054386直接作用于miR-199a-5p。结论miR-199a-5p在肝脏IRI过程中可以调节内质网适度应激保护肝细胞;但在再灌注过程中由于LncRNA AK054386的“海绵吸附”机制,导致miR-199a-5p浓度迅速下降,内质网应激持续存在,最终引起肝损伤。