杯状细胞和黏膜腺体细胞分泌粘液是鼻腔和鼻窦防御机制的重要组成部分。黏膜上皮表面形成的粘液毯可以俘获外来物质、防止机械损伤、维持黏膜表面的流动性。但是，在慢性鼻窦炎和鼻息肉时，由于粘液分泌过度，粘液的理化特性发生改变，粘性和弹性明显高于正常。这种粘液不适于粘液纤毛系统的传输，造成局部粘液的淤积，为细菌感染创造了条件。 已有研究证明，粘液的粘性和弹性主要取决于粘蛋白含量。Kim等研究鼻息肉上皮细胞粘蛋白成分的变化，发现MUC8 mRNA水平显著增高。Ishinaga等在体外培养的鼻息肉上皮细胞研究发现，地塞米松抑制由细菌内毒素诱导的MUC8基因表达。但是，皮质类固醇激素在人体内是否有相同的作用还未见研究报告。本文研究皮质类固醇激素对人体鼻息肉组织MUC8基因表达的影响。 一、材料和方法 1．实验材料 收集浙江大学医学院附属二院耳鼻咽喉科2002年6月～2003年1月期间住院手术的部分慢性鼻窦炎鼻息肉病例35例。其中，术前地塞米松治疗病例17例，男性12例，女性5例，年龄16～60岁，平均38.9±14.5岁。根据中华医学会耳鼻咽喉科学分会和中华耳鼻咽喉科杂志编辑委员会1997年在海口组织的鼻科学会议制定的慢性鼻窦炎鼻息肉临床分型分期及内窥镜鼻窦手术疗效评定标准，Ⅱ型2期8例，Ⅱ型3期8例，Ⅲ型1例。全身应用地塞米松4～7天，平均4.7±1.4天，其中10例同时给予鼻腔浙江大学硕士学位论文局部皮质类固醇激素喷剂。另18例术前一个月无类固醉激素用药史(包括鼻腔局部喷用和全身应用)，作为对照，男性14例，女性4例，年龄14~58岁，平均年龄36.3士15.2岁。临床分期，n型1期4例，n型2期9例，11型3期4例，m型1例。两组病例均在鼻内镜手术时，取鼻息肉标本，经生理盐水漂洗，去除血迹后，立即装入Eppendof管，置于一80℃冰箱贮藏备测。2.实验方法RNA提取:冰冻鼻息肉组织约50一100mg液氮中碾碎后与lml Trizo!试剂混匀，加0.2ml氯仿，用力振荡，4℃1 2000 rpm离心15分钟。再加异丙醇沉淀RNA。75%乙醇漂洗，OEPC水溶解。 cDNA的合成:取8 09总RNA样品，70℃水浴smin，立即冰浴冷却，依次加入5X逆转录反应缓冲液5协l，10mM dNTps 1.25pl，sopmololigdT引物lpl，Zoou/。-逆转录酶(Moloney murine leukemiavirus，M一MLv)一p一，4oU/p一Rnasin 0.65“一。最后加DEPC水至总体积25 pl。42oC温浴60min，95℃水浴smin灭活M一MLV酶，得到cDNA。 聚合酶链反应(Po一ymerase ehain reaction，PeR) MUCS cDNA扩增:以上述cONA为模板，用MUCS引物进行PCR，循环35个周期。引物根据基因库报导MUCS mRNA序列(Genebank aceession numbe:u一4353)设计如下:上游链5’一ACAGGGTTTCTCCTCATTG一3’;下游链5’一CGTTTATTCCAGCACTGTTC一3’。 内参照p一肌动蛋白(p一actin) cDNA扩增:同样以上述cONA为模板，以p一actin引物进行PCR。引物序列:上游链5’一TTCCAGCCTTCCTTCCTGGG一3’;下游链5一TTGCGCTCAGGAGGAGCAAI，一3’。PCR反应条件均为94oC预变性5 min，94oC变性305，55oC退火305，72oC延伸30s，循环35个周期。然后72oC延伸1 0 min。PCR产物定量取10叫PCR产物，2%琼脂糖凝胶电泳，用数字成像系统进行阳性条带的密度扫描，记录扫描值。根据扫描值计算mRNA指数(RI):RI=MUCS mRNART一PCR产物扫描值/p一actin mRNART一PCR产物扫描值RI代表组织中MUCS mRNA相对水平。浙江大学硕士学位论文二、结果 ‘矛 总RNA的提取 将提取的总RNA在紫外分光度仪260nm/2 80nm波长下测定吸光度(A)，各样品的A 260/A 280均为1.8以上。经RNA电泳，可见明显的185和285两条带，说明提取的RNA纯度符合要求并且没有降解。 RT一PCR Mucs基因扩增片段长度为239bP，在电泳图中可见扩增产物的条带位置落在25obp的Marker(分子量标记)条带稍前方，与预期目的片段大小相符，特异性高。鼻息肉组织术前用药组和对照组样本均有MUCS表达。作为内参照标准的p一actin(223bp)在两组样本表达恒定，见附图。附图鼻息肉组织中MUCS mRNA和p一actin mRNART一PCR电泳图A为MUCS;B为p一aetin。M为oNA分子量标记物;l~4为术前用药组病例标本，5~8为对照组病例标本。术前用药组病例鼻息肉组织MUCS mRNA指数平均为0.71士0.34;对照组病例鼻息肉组织RI值平均为1.12士0.26。前者较后者为低。两组间的差异经I检验，有统计学上的显著意义(P<0.01)，见附表。浙江大学硕士学位论文附表两组鼻息肉组织MUCS mRNA指数分组例数Rl值(又士50)术前用药组 对照组l7180 .71士0.341 .12士0.26三、讨论和结论 粘蛋白是鼻腔和鼻窦粘膜分泌的粘液中的主要大分子成分，是高度糖基化的蛋白质，决定粘液的粘弹性。至今已确认13种人类粘蛋白基因，包括MUCI一4，MUCSAC，MUCSB，MUC6-9，MUCll一13。这些基因编码呼吸道、胃肠道及泌尿生殖道粘蛋白的核心蛋白。其中，Mue5AC、Mue5B和MUCS主要表达