1研究背景与研究目的神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)是儿童颅脑外最常见恶性实体肿瘤,占所有小儿肿瘤8%~10%,该病具有早期临床症状不明显,发病部位隐匿,肿瘤生长迅速,恶性程度高,早期转移等特点,容易漏诊、误诊和延误治疗。目前,NB的早期诊断方法仍以彩色多普勒超声、CT和MRI为主,切除程度的判断及复发瘤的检测仍缺乏特异性的方法,早期根治性手术切除配合术后放化疗等综合治疗,效果及预后基本令人满意,但进入Ⅲ期或IV期之后,NB的生存率明显降低,且复发率高。基于NB的早期诊断、早期治疗的重要性,临床急需一个敏感度高、准确性强的诊断和监测的方法。蛋白质组学已被广泛的应用于肿瘤的研究,特别是肿瘤特异性的蛋白标记物的不断发现,大大提高了恶性肿瘤的早期诊断和早期治疗水平,同时为肿瘤的治疗提供研究方向。本课题组曾与中国科学院生物物理研究所、浙江大学肿瘤研究所联合应用蛋白质质谱技术检测肾母细胞瘤、乳腺癌、胃癌等恶性肿瘤的血清,筛选并鉴定出特异性蛋白质标记物,现已成功的在体外人工合成肾母细胞瘤特异性蛋白质多肽,在动物体内外实验阶段取得满意的疗效,有待应用于临床治疗。本课题以前期技术路线为基础,通过对正常组、肿瘤组血清的检测,筛选出特异性的蛋白质标记物,对不同分期患儿进行详细分组,再次验证并统计分析,初步建立分期诊断模型,结合随访及手术结果,将筛选出的蛋白质标记物应用于复发瘤的预测及手术切除程度的判断,最后通过定量分析并与临床常用检查方法对比,明确其临床应用的敏感性及特异性。2材料与方法2.1实验材料2.1.1临床病例资料本课题研究选取的血清样本365例均来自河南省郑州大学第一附属医院,采集时间2008年1月至2013年12月。分为正常对照组、术前组(根据INSS分期:I期,II期,Ⅲ期,IV期)、复发组、长期存活组、姑息性切除组、根治性切除组。该实验神经母细胞瘤患儿病理诊断结果均为:神经母细胞瘤(NB),所有病理样本均经穿刺活检或手术切除后取得,均送我院病理科按照统一的流程进行检查,所有病理诊断结果均得到我院两位以上的病理学专家的验证。抽血取样条件:晨起6点,所有神经母细胞瘤患儿及健康小儿均在空腹状态下抽血,留取外周静脉血5ml,室温静置1小时,后转至离心机处理,在4℃低温环境下离心20分钟,转速:3000 r/min,离心力:3000×g,抽取标本的上清液,以每管100ul进行分装,分装完毕后放入;低温冰箱储存,冰箱温度条件:-80℃。本实验均得到受试者监护人的知情同意,并通过伦理委员会的批准。2.1.2主要仪器与试剂尿素(Urea)、DTT(DL-Dithiothreitol,1,4—二硫代苏糖醇)、IAM(Iodoacetamide,碘乙酰胺)、CHAPS(3-环乙胺-1-丙磺酸)、SPA(sinapic acid,芥子酸)、TFA(Trifluoro-Acetic Acid,三氟乙酸)、超纯水(HPLC grade)和乙腈(Acetonitrile,CAN)购自Sigma公司,产地:美国;Spectra Multicolor Low Range Protein Ladder购自Thermo公司,产地:美国;Trypsin购自Promega公司,产地:美国;Profiling Kit 100 MB-WCX购自Bruker Inc公司,产地:德国。Protein Chip、WCX2 Protein Chip、PBS II+SELDI-TOF-MS和Bio-processor购自Ciphergen Biosystems公司,产地:美国;MALDI-TOF-MS购自Bruker公司,产地:德国;High performance liquid chromatography购自Shimadzu公司,产地:日本;2D-LC-LTQ-MS购自Thermo Electron公司,产地:美国;ZUCIPDAS来自浙江大学,产地:中国。2.2实验方法2.2.1小儿神经母细胞瘤血清蛋白质标记物的筛选及其临床应用的构建已经留取的血清样本在冰浴中解冻30分钟至60分钟,完成解冻后使用4℃低温离心机进行离心5分钟,离心力为:12000×g,离心出来的上清液留取备用。5μL血清样本、10μL MB-WCX Magnetic Beads、10μL MB-WCX Binding Buffer依次加入Eppendorf管中,充分振荡,植入磁珠分离器中,后加入MB-WCX Wash Buffer 100μL,MB-WCX Elution Buffer 5μL加入装有磁珠的Eppendorf管中,反复吹打,MB-WCX Stabilization Bu ffer 5μL加入待测管中,再次吹打,备用。芯片的预处理。添加稀释液U9(1%DTT、9mol/L尿素、2%CHAPS),混合并摇匀,加入弱阳离子交换芯片的孔中,96个样本可以通过弱阳离子交换芯片WCX2Protein Chip一次性得到检测,WCX2 Protein Chip插入Bio-processor工作支架中,仔细记录芯片的详细结果。应用SELDI-TOF-MS仪器检测上述结果,筛选差异性血清蛋白质标记物。整理并导出SELDI-TOF-MS实验检测数据,去除无效数据,分子质量与相对表达量的标准要统一,完整提取各个样本中蛋白质分子质量和相对表达量准确数据。SELDI-TOF-MS提取的数据经过ZUCIPDAS技术分析(浙江大学),排除并严格处理技术上的干扰,挑选出m/z差异小于0.3%的数据,并将其归为一类。Wilcoxon秩和检验对初筛的数据进行进一步处理分析初筛及不同组别的处理数据,提取m/z相同、m/z对应的峰值不同的数据,为差异性蛋白质,通过SVM筛选处理,得到组合模型,youden指数最高。质谱数据过滤噪音,聚类分析,使用SPSS17.0对m/z峰做Wilcoxon秩和检验,不同组别质谱数据进行独立样本t检验。再经过SVM筛选出youden指数最高的组合模型,得出小儿神经母细胞瘤特异性血清蛋白质标记物,统计学分析不同分期血清样本的蛋白质标记物,得出相应的表达强度数据。统计学分析复发组、长期存活组、根治性切除组、姑息性切除组患儿血清中具有差异表达的血清学标记物,得出不同组别患儿蛋白质标记物的表达强度。2.2.2小儿神经母细胞瘤血清蛋白质标记物的纯化与鉴定应用HPLC分离纯化样本中目标蛋白质,分离纯化对象根据SELDI-TOF-MS筛选结果,从中选取目标蛋白质表达量较高的肿瘤组术前血清样本。冰水浴解冻自-80℃冰箱取出的血清样本,抽取100μl血清样本。600μl ACN和300μl超纯水加入100μl血清样本中,吹打、离心,SPD Speed Vac真空冷却离心浓缩系统将上清液冻干,高效液相色谱仪中冲洗C18色谱柱对上述血清样品进行分离纯化,HPLC图上峰值中的蛋白质应用EP管收集,使用MALDI-TOF-MS对蛋白质样品进行质荷比的检测,找出质荷比与5920Da相近的的蛋白质所在的样本(大约存在0.03%的误差)。酶解目标蛋白质。串联2D-LC-LTQ-MS系统的喷雾系统与加样后的洗脱柱,进行肽质荷比图谱的检测,得到目标蛋白。应用SEQUEST程序数据检索目标蛋白质,搜索Bioworks数据库,检索出可能与所得的肽段及氨基酸相匹配的蛋白质。2.2.3小儿神经母细胞瘤血清特异性标记物的验证及敏感性/特异性分析ELISA方法对目标蛋白质(Class APO C-Ⅲ)进行定量分析。配备APO C-Ⅲ冻干标准品,浓度每2倍递增。加样器校准后,取100μl各浓度样本,吸头垂直滴加入96孔板,抗APO C-Ⅲ抗体提前预包被,同时设置3个复孔。每组各取10个血清样本,取100μl各浓度样本,吸头垂直滴加入96孔板,板块整个用封板模封闭,温箱控制严格按照说明书,酶标板孵育。各孔液体吸去后,抗人APO C-Ⅲ抗体用生物素标记,取100μl注入小孔,应用酶标板进行孵育;应用自来水和清洗剂注满孔板,清洗玻璃板、电泳槽及相关附件,在吸水纸上拍干孔内的液体,后使用通风橱,自然状态下晾干。孔板各孔充分晾干后加入ABC工作液,酶标板孵育;超纯水再次洗板,自然状态下晾干,90μl TMB显色液加入每孔中,酶标板孵育后,注入100μl TMB终止液。将酶标仪调整到450nm,显色终止15min内读出各孔吸光值,绘制标准品的吸光值标准曲线,然后计算出样品的浓度。ELISA方法对目标蛋白质(Class APO C-Ⅲ)进行定量分析的结果与临床常用诊断方法进行对比,以病理学检查结果作为判断的金标准,以验证Class APO C-Ⅲ诊断模型的敏感性及特异性。3结果3.1小儿神经母细胞瘤血清蛋白标记物的筛选标准化处理并分析肿瘤组和正常组质谱数据,提取蛋白质表达的峰值数据及蛋白质分解的肽段峰值数据信息。Wilcoxon秩和检验对蛋白质峰值数据进行处理(P<0.01),通过数据分析及统计,得到蛋白质各自表达的m/z及其峰值;对比两种数据并进行t检验(α=0.01),针对上述两组数据进行统计分析得出:神经母细胞瘤患儿血清高表达的蛋白质峰值有6个,神经母细胞瘤患儿血清低表达的蛋白质峰值有1个,通过SVM筛选处理,得到组合模型,youden指数最高,结果为:m/z 5920Da的蛋白标记物。该标记物在正常对照组中低表达,表达强度为132.87±93.41;在肿瘤组中高表达,表达强度为760.42±414.25。两组数据差异有统计学意义,P<0.01。3.2小儿神经母细胞瘤血清蛋白质标记物M/Z 5920Da对肿瘤分期的判断统计学分析质荷比为5920的蛋白质或肽段,得出其在各肿瘤分期中的表达差异。根据INSS分期分类得出I期、II期、Ⅲ期、IV期表达强度分别为422.58±120.81,663.37±219.40,930.64±278.69,1229.59±338.85,同时对正常组、NB-I期组、NB–II期组、NB-Ⅲ期组和NB-IV期组分别进行统计学分析,任意两组数据之间差异均有统计学差异,P<0.01。3.3小儿神经母细胞瘤血清蛋白质标记物M/Z 5920Da对复发瘤预测及判断对m/z 5920Da蛋白质标记物在正常对照组、术前组、复发组、长期存活组中的m/z 5920Da血清学标记物进行统计学分析,该蛋白质标记物在术前肿瘤组、复发肿瘤组中呈现高表达,表达强度分别为1125.00±577.57,1325.61±471.70;在正常对照组、长期存活组中低表达,表达强度分别为178.98±129.82,225.16±165.08;m/z 5920 Da蛋白标记物在术后复发组的表达与术前组对比,差异无统计学意义(P>0.05),与正常对照组对比差异有统计学意义(P<0.01);m/z 5920Da蛋白标记物在术后长期存活组的表达与正常组对比,差异无统计学意义(P>0.05),与术前组对比差异有统计学意义(P<0.01)。3.4小儿神经母细胞瘤血清蛋白质标记物M/Z 5920Da对手术切除程度判断对m/z 5920Da蛋白质标记物在不同手术切除程度组中的差异进行对比分析,表达强度如下:正常对照组为178.98±129.82、术前组为1125.00±577.57、姑息性切除组为1054.02±417.01、根治性切除组为625.44±338.57;m/z 5920Da蛋白标记物在姑息性切除组的表达与术前组对比,差异无统计学意义(P>0.05),与正常对照组对比差异有统计学意义(P<0.01);m/z 5920Da蛋白标记物在根治性切除组的表达与正常组对比,差异无统计学意义(P>0.05),与术前组对比差异有统计学意义(P<0.01)。3.5小儿神经母细胞瘤血清蛋白质标记物的纯化及鉴定目标蛋白质应用应用HPLC技术进行分离纯化,HPLC图上峰值中的蛋白质应用EP管收集,进行MALDI-TOF-MS检测,找出质荷比为5920Da蛋白质或肽段样品。酶解质荷比为5920 Da的蛋白质或肽段,置入2D-LC-LTQ-MS系统检测,获得PMFs,进一步检测分析获得酶解蛋白质片段氨基酸序列,导入SEQUEST程序,应用Bioworks数据库检索,匹配并获得完整的氨基酸序列图。质荷比为5920Da的蛋白质或肽段其序列为:KDALSSVQESQVAQQARGWVTDGFSSLKD YWSTVKDKFSEFWDLDPEVRPAS此肽段为类APO C-Ⅲ。3.6小儿神经母细胞瘤术前血清蛋白质标记物验证本阶段实验用ELISA方法检测小儿神经母细胞瘤不同分期类APO C-Ⅲ的含量,经过统计及数据分析,结果提示随着分期的上升,类APO C-Ⅲ的含量依次升高,正常组、I期、II期、Ⅲ期、IV期中类APO C-Ⅲ的表达量分别为545.55±176.09 pg/mL,873.55±212.59 pg/mL,1691.64±837.04 pg/mL,3155.64±495.86pg/mL,4633.91±504.01 pg/mL,各分期与正常组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。本阶段实验应用ELISA方法对正常对照组、术前组、复发组、长期存活组类APO C-Ⅲ的表达量进行定量分析,表达量分别为545.55±176.09 pg/mL,3037.33±1448.09 pg/mL,4428.09±1255.57 pg/mL,545.91±289.26 pg/mL。复发组与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),长期存活组与术前组比较差异有统计学意义(P<0.01)。本阶段实验应用ELISA方法对正常对照组、术前组、姑息性手术切除组、根治性手术切除组类APO C-Ⅲ的表达量进行定量分析,表达量分别为545.55±176.09 pg/mL,3037.33±1448.09 pg/mL,3166.18±958.38 pg/mL,1814.64±571.74 pg/mL。姑息性手术切除组与正常组通过统计学分析,差异有统计学意义(P<0.01),根治性手术切除组与术前组通过统计学分析,差异有统计学意义(P<0.01)。3.7小儿神经母细胞瘤血清蛋白质标记物的敏感性/特异性验证本阶段实验以ELISA方法对样本进行类APO C-Ⅲ定量分析,以该结果为临床诊断模型,与临床常用的辅助检查手段进行对比,如:64层CT平扫+增强、3.0MRI,以病理学检查结果作为判断的金标准,以验证类APO C-Ⅲ诊断模型的敏感性及特异性,该部分实验对象均为盲选患儿,与正常健康儿童比较,类APO C-Ⅲ诊断模型的敏感性为96.0%,特异性100%,与常见小儿腹部实体肿瘤比较,类APO C-Ⅲ诊断模型的敏感性为96.0%,特异性88.0%。4结论目标蛋白质m/z 5920Da可以作为小儿神经母细胞瘤的特异性血清生物学标记物,对临床怀疑神经母细胞瘤,可以对该蛋白质标记物进行检测。目标蛋白质m/z 5920Da可以作为小儿神经母细胞瘤的分期诊断的血清生物学标记物,对复发瘤的预警及手术切除程度的判断有重要的指导意义。通过对目标蛋白质或肽段的统计分析及鉴定,质荷比为5920Da的蛋白质或肽段初步确定为类APO C-Ⅲ。类APO C-Ⅲ在小儿神经母细胞瘤早期诊断的敏感性较其它常用影像学诊断方法具有明显的优势。类APO C-Ⅲ在小儿神经母细胞瘤与常见小儿腹部实体肿瘤鉴别的特异性较好,提示APO C-Ⅲ可能存在于多种小儿实体肿瘤中。后期研究中,须进一步扩大样本量,与其他肿瘤进行对比,以明确其特异性。同时,进一步探索类APO C-Ⅲ与NB发生发展的相互关系,从而明确类APO C-Ⅲ在NB发病机制中的关键作用。