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本研究首次以‘大五星’枇杷花药胚状体为试材,通过对不同发育时期的三类基本物质的变化进行比较,研究其变化规律,旨在探究影响枇杷花药胚状体发生发育的因素及其分子机制,为枇杷花药胚状体的培养及其成苗等相关研究提供依据;并建立了枇杷花药胚状体SDS-PAGE蛋白质垂直板电泳体系,以期找到枇杷花药胚状体发育期间的特异蛋白,为深入了解枇杷花药胚状体发育分子调控机理奠定基础。主要结果如下:
1.随着枇杷花药胚状体发育的进行,胚的体积不断增加,鲜重也随之增大,其中鱼雷胚到子叶胚增加最多。在枇杷花药胚状体的整个发育过程中,干物质含量总体上表现为:随着发育的进行逐渐上升,其积累过程是为胚胎的发育提供物质与能量的过程。
2.糖类、蛋白质、核酸三大类物质与枇杷花药胚状体的发育与成熟密切相关。在枇杷花胚状体发育的重要时期,都有蛋白质,糖类和核酸的变化。
3.枇杷花药胚状体发育过程中蛋白质的合成动态,大致呈“S”形。枇杷花药胚状体在从胚性愈伤组织到球形胚阶段的早期胚时期一直保持较高的蛋白质水平。蛋白质的两次积累高峰分别出现在胚性愈伤组织时期和子叶胚时期。在枇杷花药胚状体发育的不同时期,碱性蛋白含量总表现为高于酸性蛋白质,且碱性蛋白的变化趋势和可溶性总蛋白变化相似。
4.对不同的蛋白提取方法、丙酮干粉处理方法、上样量、考马斯亮蓝R-250染色和脱色液组合对枇杷花药胚状体电泳体系的影响的研究发现:在用改良丙酮沉淀法提取蛋白,丙酮干粉溶于上样缓冲液后先煮沸再离心,上样量为25ul,采用过滤后的0.1%考马斯亮蓝R-250震荡染色和含5%乙醇,10%醋酸的脱色液脱色的条件下,最终SDS-PAGE电泳效果最好,所得条带清楚。
5.枇杷花药胚状体发育各个时期都含相同的12种分子量的蛋白质,并以低分子量的蛋白为主。枇杷花药胚发育的不同阶段间存在组分的差异:在胚性愈伤组织、球形胚、心形胚和鱼雷胚4个时期存在22.1KD的特异蛋白;同时存在14.3KD-16.5KD的特异蛋白,只是每个时期的蛋白带数目可能不同。球形胚、心形胚和鱼雷胚具有相似的蛋白质电泳图谱,都新出现了一部分分子量较大(98.7KD以上)的蛋白,并逐渐积累;而子叶胚时期则表现为一系列低分子量蛋白(14.3KD-16.5KD)的消失。
6.在枇杷花药胚状体发育的过程中,DNA变化动态与总核酸变化动态相似,分别在胚性愈伤组织和子叶胚出现两次积累高峰,DNA合成高峰的出现先于RNA。在胚性愈伤组织时期,RNA的含量很低,而DNA合成十分活跃。从胚性愈伤组织到鱼雷胚时期,二者的比值显著增高,而到子叶胚时期则减小。
7.枇杷花药胚状体发育的过程中可溶性糖和淀粉含量的变化动态相似,两次积累高峰分别出现在在球形胚期和子叶胚期,且与蛋白质的变化是相对应的。