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目的胰腺癌是一种常见的、高度恶性的消化道肿瘤。近几十年的研究表明，其特点为早期诊断困难、手术切除率低、对放疗和化疗不甚敏感、预后极差。因此，积极寻求治疗胰腺癌的新策略以提高疗效是迫切需要解决的重要课题。近年来研究发现，缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是氧平衡调控的转录因子，在肿瘤细胞缺氧自适应过程中起着中枢调节作用，并且广泛影响着肿瘤细胞的糖代谢、增殖、凋亡和肿瘤的血管形成，使缺氧的组织细胞能保持氧稳态以耐受缺氧状态，而胰腺癌组织中有高丰度的HIF-1α表达。因此，以HIF-1α为靶点有望成为治疗胰腺癌的有效手段。腺相关病毒（AAV）载体，由于其安全性好、免疫原性低、可转导分裂细胞和非分裂细胞以及介导外源基因的长期表达等特点，已经成为基因治疗领域中研究的热点。基因治疗的新技术——RNA干扰（RNAi）技术，即将靶基因序列同源的双链RNA导入细胞，可以抑制细胞内靶基因的表达，能达到基因敲除的效果。最近报道，抗坏血酸能通过加强二价铁的利用来提高缺氧诱导因子脯氨酸羟化酶（HPH）的活性而加速HIF-1α蛋白的降解，使肿瘤细胞耐受缺氧的能力下降，抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡。因此，本实验将构建以重组腺相关病毒（rAAV）为载体和HIF-1α为靶基因的RNA干扰，联合抗坏血酸，体外观察其对厌氧培养条件下MiaPaC2人胰腺癌细胞HIF-1α蛋白和mRNA、VEGF的表达以及对MiaPaC2细胞增殖和凋亡的影响；同时，体内观察其对裸鼠皮下移植瘤的生长、增殖和血管形成能力的影响。通过初步探讨抗坏血酸和rAAV介导的HIF-1α-siRNA的抗癌机制，为今后寻找一条更加有效的基因、药物等联合治疗胰腺癌途径提供一些理论依据。方法1．rAAV介导的HIF-1α-siRNA载体的构建：提取人基因组DNA，PCR扩增人H1启动子，插入载体质粒pAAV-hrGFP的CMV启动子前方MluⅠ单克隆位点，构建成质粒pAAV-H1-hrGFP，通过测序选择人H1启动子片段正向插入的质粒pAAV-H1-hrGFP；根据HIF-1α的有效干扰位点，合成两条分别为58bp互补的寡核苷酸链，通过体外退火形成双链，然后插入pAAV-H1-hrGFP的H1启动子尾部XbaⅠ和MunⅠ位点，构建成质粒pAAV-H1-siRNA-hrGFP；利用磷酸钙共沉淀法将载体质粒pAAV-H1-siRNA-hrGFP和辅助质粒pAAV-RC、pHelper共转染HEK293细胞，“氯仿处理-PEG／NaCl沉淀-氯仿抽提”三步法浓缩和纯化rAAV，SDS-PAGE法检测病毒的纯度，电镜观察病毒形态和ELISA法测定病毒滴度。2．体外实验：将实验分为5组，分别是空白对照组、空载病毒组（rAAV-hrGFP）、干扰病毒组（rAAV-HIF-1α-siRNA）、抗坏血酸组（L-ascorbate）及联合组（rAAV-HIF-1α-siRNA+L-ascorbate）。rAAV均是以1×106v．p／cell转染MiaPaC2人胰腺癌细胞，加入的L-ascorbate终浓度为25μM，在厌氧条件下培养，利用Real-Time PCR法、Western Blot法、ELISA法、TUNEL法、MTT法分别观察各组胰腺癌细胞HIF-1αmRNA、HIF-1α蛋白和VEGF表达水平的变化以及各组细胞的凋亡和增殖情况。3．体内实验：将对数生长期的MiaPaC2人胰腺癌细胞以5.0×106个接种于25只裸鼠背部皮下建立裸鼠肿瘤移植模型，同样分上述五组，rAAV是以1.0×1011v．p进行裸鼠右后腿胫骨前肌肌注，L-ascorbate是以100mg／kg／day灌胃，每3天测量一次肿瘤大小并绘制肿瘤生长曲线。30天后处死荷瘤裸鼠，取下肿瘤标本，备常规HE染色和免疫组化染色，观察各组肿瘤标本HIF-1α、PCNA、CD34的表达并计数血管密度（MVD）。结果1．构建的质粒pAAV-H1-hrGFP，通过酶切以及测序鉴定结果正确；构建的质粒pAAV-H1-siRNA-hrGFP，通过酶切及测序鉴定结果也正确；包装的rAAV经电镜检测形态正常，SDS-PAGE法检测病毒的纯度高，ELISA法检测滴度达1.2×1012v．p／ml。2．体外实验：在厌氧培养条件下，Real-Time PCR研究表明，rAAV-HIF-1α-siRNA作用于MiaPaC2人胰腺癌细胞24h后，与对照组相比，HIF-1αmRNA的表达明显下降，48h几乎下降90％。而L-ascorbate对HIF-1αmRNA的表达未发现有任何影响。Western Blot研究发现，rAAV-HIF-1α-siRNA和L-ascorbate作用于MiaPaC2细胞24h后，与对照组比，HIF-1α蛋白明显下降；在联合组中，48h下降更为显著，几乎达到高峰，超过90％的HIF-1α蛋白表达受抑。ELISA法检测发现，rAAV-HIF-1α-siRNA和L-ascorbate都有抑制胰腺癌细胞分泌VEGF的作用，且48h的联合组抑制VEGF的分泌作用更加显著，而rAAV-HIF-1α-siRNA抑制VEGF分泌的作用远远强于L-ascorbate，差异有显著性（P＜0.01）。通过TUNEL细胞原位凋亡检测发现，rAAV-HIF-1α-siRNA和L-ascorbate都有促进细胞凋亡的作用，且rAAV-HIF-1α-siRNA促进细胞凋亡最为明显。MTT法检测肿瘤细胞的增殖活性发现，rAAV-HIF-1α-siRNA和L-ascorbate都有抑制细胞增殖的作用，而联合组抑制细胞增殖的作用最强。然而，rAAV-hrGFP对胰腺癌细胞HIF-1α的表达、VEGF的分泌、增殖和凋亡，与对照组相比，未见明显显著性差异（P＞0.05）。3．体内实验：从肿瘤的生长曲线图中，我们发现，空白对照组与空载病毒组之间未发现有显著性差异；抗坏血酸组在肿瘤生长的早、中期与空白对照组相比，差异有显著性，而在晚期阶段未发现有显著性差异；干扰病毒组以及联合组与空白对照组相比，差异也有显著性。免疫组化研究发现，空载病毒组与对照组相比，HIF-1α、PCNA、CD34的表达未发现有显著性差异（P＞0.05），而对照组与L-ascorbate组、干扰病毒组、联合组相比，HIF-1α、PCNA、CD34的表达，差异有显著性（P＜0.01）。结论1．成功构建了rAAV介导的HIF-1α-siRNA表达载体，为体内外试验奠定了基础。2．体外实验表明，在厌氧培养条件下，rAAV-HIF-1α-siRNA有抑制MiaPaC2人胰腺癌细胞HIF-1αmRNA表达的作用，而L-ascorbate对HIF-1αmRNA的表达没有影响。rAAV-HIF-1α-siRNA和L-ascorbate都可抑制MiaPaC2细胞HIF-1α蛋白表达和VEGF分泌的作用，并且其联合作用远远大于其单独作用。另外，rAAV-HIF-1α-siRNA和L-ascorbate都有促进厌氧培养条件下MiaPaC2人胰腺癌细胞凋亡、抑制其增殖的作用，且联合作用更加显著。3．体内实验表明，rAAV-HIF-1α-siRNA和L-ascorbate都有抑制裸鼠皮下移植瘤生长的作用，同时，HIF-1α、PCNA和CD34蛋白的表达下降、肿瘤组织的MVD下降。而L-ascorbate抑制裸鼠移植瘤生长的作用主要表现在肿瘤生长的早、中期。