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化学农药是防治病原生物方便、有效和普遍的一种方法,但在有效提高农业生产经济效益的同时,亦会引发许多健康和环境问题。一些药用植物中蕴含大量的抗菌蛋白,克隆编码这些蛋白的基因,通过植物基因工程技术利用这些基因,可有效降低病害对农业生产造成的损失。本研究以我国传统中草药杜仲为材料,对杜仲几丁质酶家族的多个基因进行克隆,表达分析和功能研究。本论文中取得的这些研究结果,为杜仲抗真菌研究提供了基础数据。1.杜仲几丁质酶基因克隆与分析本研究对实验室前期构建的杜仲转录组数据库进行分析,筛选出15条可能的杜仲几丁质酶基因片段,以实验室试验示范基地种植10余年的杜仲树为材料,于开花结果期分别采集雌雄株幼芽、叶片、树皮及幼果提取总RNA,反转录为cDNA,利用RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技术扩增目的基因的5’端和3’端序列,经拼接后,根据全长序列设计引物扩增获得全长cDNA序列。经测序证明获得3个具有完整开放阅读框的杜仲几丁质酶基因EuCHIT1,EuCHIT2和EuCHIT3序列长度分别为1402 bp,1218 bp和1269 bp。对EuCHIT1、EuCHIT2和EuCHIT3的保守区和motif分析,结果表明EuCHIT1和EuCHIT2属于几丁质酶糖苷水解酶19家族,而EuCHIT3属于几丁质酶糖苷水解酶18家族。与来源于昆虫、细菌、真菌以及其他植物的几丁质酶进行进化树分析,发现这3个杜仲几丁质酶均与其他植物的几丁质酶聚在一起,说明他们与其他植物的几丁质酶具有共同的进化祖先。2.杜仲几丁质酶基因的表达特征分别提取杜仲的根、嫩茎皮、嫩叶和老茎皮的总RNA反转录cDNA,使用qRT-PCR对杜仲各组织中的EuCHIT1、EuCHIT2、EuCHIT3的相对表达量进行分析。结果表明3个基因在嫩茎中的表达量均高于其他组织。EuCHIT1和EuCHIT 2在嫩叶中的表达量比嫩茎中的低,但高于其他组织。EuCHIT3在叶,老茎和根中的表达量没有显著差异。以镰刀菌浸染杜仲幼苗根部,以浸染前和侵染后24、48、72和96 h杜仲幼苗感染部分以上的嫩茎为材料,利用qRT-PCR分析EuCHIT1、EuCHIT2和EuCHIT3的表达模式。结果表明,EuCHIT1和EuCHIT2的表达量在接菌后72 h达到最大值,分别为接菌前的13.6倍和5.77倍。EuCHIT3基因表达量在接种后48 h达到最大值为接菌前的2.75倍。对该样品进行蛋白组分分析,结果表明接种72 h后的差异表达蛋白的数量最多,上调蛋白有18个,下调蛋白有69个。值得注意的是β-葡萄糖苷酶和磷脂酶Dα在接种后一直处于下调状态。接菌后蛋白组仅仅检测到几丁质酶EuCHIT2,且接菌24 h后EuCHIT2表达量下调的。GO分析发现膜整合蛋白、DNA转录激活因子和Ca2+离子应答受体在接种后被剧烈调节,与植物抗病相关的丝氨酸/苏氨酸激酶被激活。KEGG分析显示与尖孢镰刀菌胁迫相关的几条途径中均上调的蛋白是结合免疫球蛋白（binding immunoglobulin protein,Bip）。3.EuCHIT1和EuCHIT2过表达载体对烟草的遗传转化以EuCHIT1和EuCHIT2基因构建植物表达载体pSH-35S-EuCHIT1和pSH-35S-EuCHIT2,以农杆菌LBA4404菌株,利用农杆菌介导法遗传转化烟草（Nicotiana tabacum CV.Xanthin）,抗性植株经Gus组织化学染色以及PCR检测验证后,分别获得EuCHIT1和EuCHIT2转基因烟草35株和36株。4.EuCHITs对烟草几丁质酶活性的影响对野生型烟草和转EuCHIT1和EuCHIT2基因烟草T1代植株,几丁质酶活性进行分析。结果表明EuCHIT1和EuCHIT2基因能提高烟草总几丁质酶酶活。未感染病害时转EuCHIT1基因烟草的平均酶活是野生型烟草的2.4倍,转EuCHIT2基因烟草的平均酶活是野生型的2.11倍。但在接种烟草灰霉菌B.cinerea（Botrytis.cinerea）后野生型烟草几丁质酶活性的提高幅度明显高于转EuCHIT1基因烟草,从接菌前到6 h野生型烟草的酶活升高了1.866倍,而转基因烟草只升高了1.19倍。转EuCHIT2烟草在接种白粉病后几丁质酶的酶活相比接菌前仅仅提高了0.32倍,在接种病原真菌后转基因和野生型烟草的几丁质酶活性没有显著差异。说明杜仲几丁质酶基因能够提高烟草中的总几丁质酶活性,然而在接种真菌病害后,几丁质酶活性的增长在EuCHIT1和EuCHIT2转基因烟草中并不明显。5.EuCHIT1和EuCHIT2基因对烟草抗病性的影响对相同生理状态的野生型和转EuCHIT1基因烟草离体叶片接种灰霉菌（B.cinerea,HM）,发现接种后第二天转基因和野生型烟草均开始出现水浸样病斑,随着接种时间的延长病斑扩大,整个染病过程中以第4天的病征差异最大,接菌后第4天,野生型烟草病斑直径和3个转基因烟草株系EuCHIT1-31、EuCHIT-37和EuCHIT-151病斑直径平均值分别为2.6、1.2、1.8和1.7 cm,转基因植株的病斑直径菌显著小于野生型,说明过表达EuCHIT1显著提高了烟草对灰霉菌的抗性。野生型烟草和转EuCHIT2基因烟草叶片在接种烟草白粉菌（Erysiphe cichoracearum DC）后的前两天,均未见病斑形成。接种第3天,野生型和其中一个转基因株系EuCHIT2-2叶片上开始出现病斑,且野生烟草叶片上的病斑明显大于转基因烟草,随时间延长病斑增大。在接种第12天时野生型烟草表面布满白粉菌菌丝和孢子,而转基因烟草叶片的表面菌丝和孢子相对较少。测量单位面积病叶上的孢子数量分别为株系EuCHIT2-1、69444个/cm2;株系EuCHIT2-2、186111个/cm2和株系EuCHIT2-15、33333个/cm2;野生型、327778个/cm2,说明过表达EuCHIT2能够提高烟草对白粉菌的抗性。6.EuCHITs对烟草病程相关蛋白基因表达的影响利用qRT-PCR对接种烟草灰霉菌前后野生型和转基因烟草植株抗病相关的病程相关蛋白（pathogenesis related protein 1a,PR-1a）基因和冠瘿瘤不敏感基因（Coronatine insensitive 1,COI1）的相对表达量进行分析,结果显示转EuCHIT1烟草接菌前三个株系的COI1基因的相对表达量分别是野生型的1.75,2.04和2.28倍。但转基因烟草在接种灰霉菌后COI1基因的表达量相对于接种前显著降低。说明过表达EuCHIT1基因能够提高接菌前烟草中COI1基因的相对表达量,而接菌后过表达EuCHIT1对烟草的COI1基因表达有抑制作用。对PR-1a相对表达量的分析结果表明,3个转基因株系在接菌前的相对表达量分别是野生型的4.75,3.84和2.74倍。转基因烟草PR-1a的表达量在72 h时达到最高,是野生型烟草最高值（6h）的33.8倍。说明转入EuCHIT1的烟草在接种灰霉菌前后都增加了PR-1a的表达。对转EuCHIT2基因烟草和野生型烟草感染白粉病前后的相对表达量进行分析,结果表明接菌前3个转基因烟草株系的COI1基因相对表达量分别是野生型的1.31,2.07和1.2倍。接种白粉病后野生型烟草的COI1基因在24 h达到峰值,相对表达量为接菌前的3.6倍。转基因烟草在接种白粉病后COI1基因相对表达量反而下调,说明EuCHIT2基因能够提高接菌前烟草COI1基因的相对表达量,但接种白粉病后转基因烟草中的COI1基因的相对表达量反而被抑制。PR-1a的相对表达量分析结果表明,在接菌前3个株系转基因烟草的PR-1a相对表达量分别是野生型烟草的2.67,1.23和2.29倍。接菌72 h后3个转基因烟草株系的中PR-1a的相对表达量分别是野生型的307.22,112.22和146.67倍,接菌后转基因烟草中PR-1a的相对表达量明显高于野生型烟草中PR-1a的相对表达量。说明在EuCHIT2提高对烟草白粉病的抗性,可能与促进PR-1a表达量提高有关。7.EuCHIT1和EuCHIT2对烟草保护性酶活性的影响对过氧化物酶（Peroxidase,POD）,过氧化氢酶（Catalase,CAT）的酶活和丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量测定结果表明。在对转EuCHIT1烟草和野生型烟草的比较中,发现转基因烟草中CAT的活性在接种灰霉菌72 h为122.40 U/g,显著高于野生型烟草中的酶活50.49 U/g。这一结果说明转入EuCHIT1基因,能显著提高烟草在感染灰霉菌后的CAT酶活性,对感染的植物细胞膜起到了保护作用。接菌前转基因烟草叶片的MDA的含量为5.7 mmol/g,显著低于野生型烟草（9.4 mmol/g）（P<0.05）,接菌72 h转基因烟草的MDA的含量为8.7 mmol/g显著低于同一时间的野生型烟草（10.5mmol/g）。在对转EuCHIT2的转基因烟草及野生型的比较中,接种白粉菌前的转EuCHIT2烟草POD活性和接菌后12和24 h均高于野生型烟草的酶活,分别为5158和3425 U/g;8625和4716 U/g;10816和3450 U/g。并且在接种前和接种后转EuCHIT2基因烟草中的MDA的含量均低于野生型。上述结果说明在EuCHIT1和EuCHIT2介导的抗烟草真菌病害的过程中,能提高烟草的POD或CAT酶的活性来避免超敏反应对植物细胞的损坏。