聚合物包载血红蛋白氧气气泡的制备研究

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源于肿瘤的快速生长与脉管异常分布,乏氧是实体肿瘤普遍存在的特征,该特征极易导致诸如化疗、放疗、光动力治疗等肿瘤治疗手段出现耐受,最终加速肿瘤的恶化和转移。近年来,随着诸多纳米技术的发展与微纳载体的出现,研究者们构建了多种氧载体,用于改善肿瘤乏氧情况,截停肿瘤细胞无氧呼吸机制,抑制其高速增殖,从而保证肿瘤治疗效果。本文以聚乙烯醇(PVA)与外消旋聚乳酸(PDLLA)为膜壳,构建聚合物氧气气泡,并进一步通过装载血红蛋白分子,提高载氧量和载氧的稳定性,使其为肿瘤细胞定量、稳定递送氧气,以达到杀伤效果。该论文主要研究内容如下:首先,研究了复乳法制备W1/O/W2聚合物微囊与气泡材料的制备工艺参数。结果表明,经超声波以频率1 MHz,功率200 W,振幅为40%,脉冲模式每周期乳化2 s暂停1s,共计1 min的初乳化后,于800 rpm机械搅拌3 h后可制备稳定的复乳微囊结构;进而在800 rpm和1500 rpm差速离心条件下,可获得平均粒径为710 nm,Zeta电位为-28.1 m V,浓度可达10~8个/m L的聚合物氧气微泡结构。经光学显微镜、SEM、TEM等表征可见,氧气气泡形貌良好,尺寸均一,分布均匀。进而,引入血红蛋白分子提升聚合物材料载氧量。将血红蛋白包裹在聚合物囊泡内核中,傅里叶红外光谱表征显示,包裹血红蛋白的聚合物囊泡保留了血红蛋白分子的两个特征峰。经测量,包载血红蛋白的聚合物氧气气泡材料粒径均值为1.62μm,Zeta电位为-26.6 m V,浓度为10~8个/m L,血红蛋白分子的包封率达到73.02%。以冻干粉末方式保存时,血红蛋白分子的包裹情况维持良好。且经超声治疗仪以1 W/cm~2强度对材料进行10 min超声爆破,测定其溶解氧浓度由2.17 mg/L提升至12.33 mg/L。同时,经过超声成像系统测定,聚合物氧气气泡具有明显的超声显影效应,而添加血红蛋白的聚合物氧气气泡超声造影灰度值则提高至前者200%以上。最后,研究了聚合物氧气气泡供氧对肿瘤细胞的作用。通过聚合物膜壳包裹血红蛋白的氧气气泡(PVA-Hb-O2),包裹自由氧气的气泡(PVA-O2),包裹血红蛋白的微囊(PVA-Hb)三组囊泡材料与Hep G-2肝癌细胞、SMMC-7721肝癌细胞及U87MG脑胶质瘤细胞的相互作用,以激光共聚焦显微镜观察到三种肿瘤细胞分别在4 h、4h、8 h对各组材料出现明显摄取现象。流式细胞仪定量测量其存活细胞内的材料含量,几乎无细胞毒性的PVA-Hb组材料分别为89.3%、81.7%、87.4%;氧气气泡材料组别则24 h内随时间先升高后降低,PVA-O2组达到73.3%、17.9%、42.8%;PVA-Hb-O2组由于更高的载氧量达到13.1%、0.4%、7.9%。CCK-8法测定PVA-Hb-O2组材料作用于三种肿瘤细胞24h后的细胞存活率分别为76.7%、51.8%、46.2%,而对照的PVA-O2组存活率分别为81.4%、56.5%、60.3%,PVA-Hb组存活率分别为98.81%、88.73%、72.2%。
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