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本论文在国家基金项目《水蛭酶解物抗凝活性肽类物质基础及作用机制研究》的研究基础上,进一步对我国市场上的主流水蛭品种-蚂蟥的酶解物的抗凝活性成分进行了探究,同时研究了不同品种水蛭的抗凝作用机制,主要实验方法及结果如下所述。一.蚂蟥酶解物抗凝活性肽类物质研究1.蚂蟥酶解物不同分子量部位的获得及其抗凝活性采用分级超滤法,得到蚂蟥酶解物中的不同分子量肽段,以凝血酶时间(TT)为指标,测定各肽段的抗凝活性;同时以外翻肠囊为模型,确定蚂蟥酶解物中分子量大于10 KD肽段与分子量小于10 KD肽段经肠吸收后的抗凝活性。结果:蚂蟥酶解物抗凝活性分散,其分子量小于10 KD的肽段虽然表现出较弱的体外抗凝活性,但经肠吸收后其活性反而更加显著。结论:蚂蟥酶解物发挥抗凝活性的物质应集中在分子量较小的肽类中。2.蚂蟥酶解物不同极性部位的获得及其抗凝活性采用C18反相色谱法对蚂蟥酶解物中分子量小于10 KD部位进行进一步分离,以凝血酶时间(TT)为抗凝活性指标,测定所得各组分的抗凝活性;以外翻肠囊为模型,研究各组分经大鼠的肠吸收后的抗凝活性。结果:蚂蟥酶解物中分子量小于10kd部位中的大极性部位(LF0-1)体外抗凝活性更好,且更容易被肠吸收。结论:蚂蟥酶解物经两步分离后得到了一个抗凝活性部位LF0-1。3.蚂蟥酶解物抗凝活性部位的多肽成分分析通过超滤法、C18反相柱层析法后,从蚂蟥酶解物中分离得到一个抗凝活性较显著的部位,即LF0-1,本论文将此部位进行LTQ-Obitrap质谱分析,得到多个多肽蛋白的数据信息,将此数据采用uniprot软件进行数据库搜索匹配。结果:通过质谱分析后,得到五千多个肽段信息,但是由于水蛭已知蛋白多肽结构较少,数据库不完整,无法比对,通过已有库搜索,只鉴定出42个多肽、26个蛋白。结论:蚂蟥酶解物成分复杂,其抗凝物质基础有待进一步研究。4.蚂蟥酶解物中凝血酶直接抑制剂的分离采用本课题组前期制备的一种凝血酶-亲和色谱,筛选蚂蟥酶解物中的抗凝血酶成分,并测定所得成分与凝血酶的作用及其抗凝血活性。结果:蚂蟥酶解物经亲和色谱法分离所得成分不具有凝血酶抑制活性和抗凝血活性。结论:凝血酶可能不是蚂蟥抗凝的作用靶点。二.不同品种水蛭对凝血途径的作用研究选择蚂蟥清水吊干品、干品菲牛蛭、鲜品菲牛蛭三种水蛭,参照《中国药典》的凝血酶滴定法评价三者的抗凝血活性;采用凝固法测定三者的部分凝血酶原时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)。结果:凝血酶滴定法结果表明不同水蛭的抗凝活性顺序依次为:鲜品菲牛蛭>干品菲牛蛭>>蚂蟥清水吊干品;凝固法测定结果显示不同水蛭样品均使APTT、PT、TT延长,鲜品菲牛蛭主要延长TT,干品菲牛蛭主要延长APTT,蚂蟥清水吊干品使APTT、TT延长更加显著。结论:不同品种水蛭的抗凝活性差异较大,且对凝血途径的影响不同。三.不同品种水蛭对凝血共同途径的作用机制研究1.不同品种水蛭对凝血酶的作用研究首先,采用发色底物法测定蚂蟥酶解物的抑凝血酶活性;其次,采用发色底物法-萃取-HPLC法测定蚂蟥酶解物、蚂蟥清水吊干品、干品菲牛蛭及鲜品菲牛蛭对凝血酶的作用。结果:蚂蟥酶解物中由于胰蛋白酶的干扰无法测定其对凝血酶的作用,而蚂蟥清水吊干品、干品菲牛蛭及鲜品菲牛蛭三种水蛭提取物对凝血酶的作用均表现出低浓度促进,高浓度抑制,且菲牛蛭具有强烈凝血酶抑制活性,而蚂蟥在加入更高剂量时才表现出抑制作用,且抑制作用较弱。结论:本实验首次明确水蛭对凝血酶的作用表现出低浓度促进,高浓度抑制,且蚂横对凝血酶的抑制作用更弱。2.不同品种水蛭对纤维蛋白原的作用研究选择蚂蟥清水吊干品、干品菲牛蛭、鲜品菲牛蛭三种水蛭,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法检测三种水蛭对纤维蛋白原的作用。结果:蚂蟥能够水解纤维蛋白原,对α、Β链作用较强,干品与鲜品菲牛蛭均对纤维蛋白原无作用。结论:不同品种水蛭对纤维蛋白原作用不同,蚂蟥具有裂解纤维蛋白原的作用。