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糖化酶属于一种淀粉酶,拥有水解全部D-葡萄糖苷键的能力,工业生产的糖化酶具有热稳定性、pH稳定性、底物特异性等特性。淀粉酶的市场已发展成为工业酶的第二大市场,具有十分重要的研究价值。但在黑曲霉产糖化酶发酵过程放大中始终无法达到实验室规模的产品得率。不均匀的混合是影响工艺放大的关键因素,微生物在波动环境中的动态响应可能是导致放大困难的关键原因。因此,本文主要通过Scale-down实验模拟了大规模发酵过程中的浓度梯度(底物和溶解氧梯度),研究了黑曲霉胞内代谢物动态响应规律和对产物得率的影响。首先采用稀释率为0.08 h-1的恒化培养,通过高、低浓度的过量葡萄糖浓缩液脉冲刺激,研究了黑曲霉胞内外代谢产物的动态响应。发现碳通量通过中心碳代谢(central carbon metabolism,CCM)的周转时间合计约250 s(其中PP途径50 s,EMP途径20 s,TCA循环189 s),并估算出CCM中各代谢物浓度的上限。同时在本研究的黑曲霉菌株中观察到其他菌种中发现的ATP悖论。随后,通过自行设计的脉冲装置进行周期性底物脉冲,模拟了大规模生产存在的底物梯度,使微生物反复经历“盛宴/饥饿”循环,发现大部分胞内响应与单次低浓度葡萄糖脉冲响应相同。但周期性底物脉冲后,菌体的生物量有6%的降低,而糖化酶的得率有12%的升高。在胞内氨基酸的测定中发现菌体合成前体氨基酸Glu与Lys的降低和糖化酶合成前体氨基酸Ala和Leu的升高,这可能是造成菌浓降低和产量升高的原因。溶氧是影响菌体生长代谢的另外一大重要因素,设计了溶氧波动装置来对大规模生产的溶解氧梯度进行模拟,溶氧周期性限制-脉冲实验结果表明,溶氧的限制对产物和副产物的形成均有促进作用,糖化酶比生成速率提高了37%;对菌体生长也有较大影响,使得菌浓降低了72%。溶氧的限制导致EMP和PP途径中的胞内代谢物(除3PG外)呈下降趋势,其中Asp和ATP等代谢物同溶解氧有显著正相关。