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前言Bim(Bcl-2 interacting mediator of cell death)是Bcl-2家族中仅含有一个BH3结构域的蛋白,具有助凋亡活性,广泛分布在机体各种组织,对防御自身免疫、维持造血细胞稳态有重要意义,并具有肿瘤抑制因子活性。不同的细胞Bim表达和功能的调节方式各异,包括转录水平、亚细胞定位、磷酸化调节等。Bim转录水平调控十分复杂,可受到多种信号途径的调节,已报道的有MLK/JNK,PI3K/AKT以及RAS/MAPK途径。现有许多研究表明PI3K/Akt信号通路异常,与肿瘤的发生发展关系密切。本教研组的前期工作发现,PI3K-Akt-Bad通路在乳腺癌的发生发展过程中有重要作用,Bim、Bad同属于BH3-only亚家族,那么在乳腺癌的发生发展中,Bim是否扮演着同样重要的角色,这对指导乳腺癌的临床诊断和治疗有重要意义。材料和方法1、材料人乳腺正常上皮细胞系MCF-10A、及人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231及MDA-MB-435S,30例新鲜乳腺癌组织及30例癌旁新鲜乳腺组织,101例乳腺组织取自于中国医科大学附属第一医院2001年1月至2007年5月手术切除标本。2、主要试剂兔抗人Bim多克隆抗体,兔抗人p-Akt1/2/3(Ser473)多克隆抗体,PI3K/AKT特异性抑制剂LY294002均购自Cell Signaling公司。Western Blotting用二抗、兔抗人多克隆anti-β-actin抗体(PR-0255)、荧光二抗、HEST均购自中山生物技术有限公司。RNA抽提试剂盒Trizol购自Invitrogen公司,RT-PCR试剂盒购自大连TaKaRa公司,引物序列合成由TaKaRa公司完成。3、方法(1)免疫荧光方法检测Bim在正常乳腺上皮细胞系MCF-10A及人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231及MDA-MB-435S中的表达。(2)免疫组织化学(S-P)法检测Bim蛋白在乳腺各组病变组织中的表达。(3)Western Blotting,RT-PCR分别检测Bim蛋白及Bim mRNA在正常乳腺上皮细胞系及三种乳腺癌细胞系中的表达。(4)Western Blotting检测乳腺癌与癌旁乳腺组织中Bim、p-Akt蛋白的表达。(5)Western Blotting检测用LY294002阻断PI3K/AKT信号通路后乳腺癌细胞中Bim和P-AKT蛋白表达的变化。(6)采用SPSS13.0统计学软件对Western Blotting及RT-PCR图像灰度值进行t检验和Pearson相关性检验,确定p＜0.05有统计学意义。结果1、免疫荧光方法结果显示Bim是一种浆表达蛋白。在正常乳腺上皮细胞MCF-10A、及人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435S中都呈阳性表达。2、正常乳腺上皮细胞系MCF-10A中Bim蛋白及Bim mRNA的表达均高于MCF-7、MDA-MB-231及MDA-MB-435S三种乳腺癌细胞系,p值分别p=0.003及p=0.009。3、Bim蛋白在乳腺导管内增生性病变及浸润性导管癌组织中阳性表达率逐渐降低,在乳腺普通导管增生与乳腺导管重度不典型及原位癌组间、重度不典型及原位癌和浸润性导管癌组间阳性表达率差异均具有统计学意义(p=0.026;p=0.014)。Bim蛋白表达与患者的临床分期、淋巴结转移无明显关系,但与组织学分级有关(p=0.033),且组织学分级越低,Bim蛋白阳性表达率越低。4、Bim和p-Akt在30例乳腺癌组织和癌旁正常组织中均有不同程度的表达。其中Bim蛋白在癌组织中的表达明显低于对应的正常乳腺组织,平均灰度值分别是0.322±0.138和0.591±0.130(p=0.001)。p-Akt蛋白在癌组织中的表达明显高于对应正常乳腺组织,平均灰度值分别是0.710±0.219和0.412±0.115(p=0.002)。两种蛋白在乳腺癌组织中表达呈负相关性(r=-0.489 p=0.039)。5、将不同浓度的LY294002(0、10、25、50μmol/L)加入培养液后24h,用Western Blotting检测显示,乳腺癌细胞MCF-7中p-Akt蛋白水平下降,Bim蛋白表达水平升高(p＜0.05)。结论1、正常乳腺上皮细胞系Bim蛋白及Bim mRNA的表达均高于乳腺癌细胞系。2、Bim蛋白的表达在乳腺癌癌变过程中呈递减趋势。Bim蛋白的表达与乳腺癌组织学分级有关,组织学分化程度越低,蛋白阳性表达率越低。3、Bim在癌旁正常组织中的表达均高于癌组织,p-Akt在癌旁正常组织中的表达均低于癌组织。且这两种蛋白在乳腺癌组织中的表达量呈负相关性。4、加入p-Akt活性抑制剂LY294002后,Bim蛋白表达水平逐渐升高,提示在乳腺癌细胞中,Bim蛋白表达可能通过PI3K/AKT信号通路来调控。