【摘 要】
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氮素是作物生长发育过程需求量最大的营养元素之一,也是限制作物产量和品质的主要因素。大量施用氮肥不仅会造成资源的巨大浪费,增加农民负担,而且还会导致土壤酸化、水体富营养化和大气污染等一系列环境问题。因此,充分挖掘并利用作物氮高效基因,对于提高作物氮肥利用效率、发展资源节约型和环境友好型农业具有重要意义。植物NRT1.1B基因参与了硝酸盐的感知、吸收和转运,是植物氮素吸收利用的关键基因。研究发现在拟南
【基金项目】
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国家重点研发计划项目（2018YFD1000700和2018YFD1000704）；
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氮素是作物生长发育过程需求量最大的营养元素之一,也是限制作物产量和品质的主要因素。大量施用氮肥不仅会造成资源的巨大浪费,增加农民负担,而且还会导致土壤酸化、水体富营养化和大气污染等一系列环境问题。因此,充分挖掘并利用作物氮高效基因,对于提高作物氮肥利用效率、发展资源节约型和环境友好型农业具有重要意义。植物NRT1.1B基因参与了硝酸盐的感知、吸收和转运,是植物氮素吸收利用的关键基因。研究发现在拟南芥、水稻和高粱等植物中仅有1个拷贝的NRT1.1B基因,而在谷子中却有两个拷贝,分别为SiNRT1.1B1（Si9g32650）和SiNRT1.1B2（Si9g32660）。据此推测,谷子高效氮素吸收利用的特性可能与NRT1.1B基因的拷贝数有关。本文研究了SiNRT1.1Bs基因的功能,为揭示谷子耐低氮的分子机制和氮高效作物育种奠定基础。1、利用花序浸染法将谷子SiNRT1.1B1和SiNRT1.1B2转入拟南芥NRT1.1基因功能缺失突变体atnrt1.1中。获得T1代SiNRT1.1B1转基因拟南芥植株30株,通过两代筛选,获得2个SiNRT1.1B1转基因拟南芥纯合株系;获得T1代NRT1.1B2转基因拟南芥植株33株,通过两代筛选,获得3个SiNRT1.1B2转基因拟南芥纯合株系,为后期SiNRT1.1B基因功能研究提供试验材料。2、NRT1.1也可以结合并转运硝酸盐的同系物氯酸盐,但氯酸盐对植物生长发育有毒害作用。拟南芥atnrt1.1突变体对氯酸盐毒害的敏感性降低。研究了转基因拟南芥对氯酸盐毒害的敏感性以及不同浓度硝酸盐诱导下的根系生长变化情况,结果表明谷子SiNRT1.1B1和SiNRT1.1B2基因均具有硝酸盐转运能力,可以恢复拟南芥atnrt1.1突变体对氯酸盐的敏感性。3、为了明确谷子SiNRT1.1Bs蛋白的亚细胞定位,构建了163GFP-SiNRT1.1B1和163GFP-SiNRT1.1B2融合载体,并将其转到拟南芥原生质体中。亚细胞定位结果表明硝酸盐转运蛋白SiNRT1.1B1和SiNRT1.1B2均定位于细胞膜上。4、多形汉逊酵母硝酸盐转运蛋白基因YNT1功能缺失突变体Δynt在硝酸盐浓度低于500μM的情况下无法转运吸收硝酸盐,导致不能正常生长。为了验证谷子SiNRT1.1B1和SiNRT1.1B2基因是否可以转运硝酸盐,将其分别转入多形汉逊酵母突变体Δynt-leu中,进行遗传互补试验。在0.5 m M硝酸钾为唯一氮源的YGNL培养基上,两个基因的转基因酵母与野生型生长状况基本一致。进一步的氯酸盐敏感性试验表明SiNRT1.1B1和SiNRT1.1B2基因可以恢复酵母对氯酸盐敏感性。这些结果表明谷子中的SiNRT1.1B1和SiNRT1.1B2基因均具有硝酸盐转运功能。5、将谷子SiNRT1.1B1和SiNRT1.1B2基因转入水稻中,利用RT-PCR对表达量进行了检测,获得2个SiNRT1.1B1转基因株系和5个SiNRT1.1B2转基因株系水稻,为后续进行功能研究提供了试验材料。此外,为了进一步揭示SiNRT1.1Bs基因拷贝数对谷子氮素吸收转运效率的影响,构建了2个靶向SiNRT1.1B1基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体p HUE411-NRT1.1B1-1和p HUE411-NRT1.1B1-2,2个靶向SiNRT1.1B2基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体p HUE411-NRT1.1B2-1和p HUE411-NRT1.1B2-2,2个同时靶向SiNRT1.1B1和SiNRT1.1B2基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体p HUE411-NRT1.1Bs-1和p HUE411-NRT1.1Bs-2。然后进行了谷子原生质体转化,检测基因编辑情况,结果显示6个基因编辑载体均有剪切活性,将用于后续的谷子遗传转化。本研究通过拟南芥和酵母遗传互补试验证明谷子中SiNRT.1.1B1和SiNRT1.1B2均具有硝酸盐转运功能,亚细胞定位结果显示SiNRT1.1B1和SiNRT1.1B2均定位于细胞膜,进一步暗示了谷子中SiNRT.1.1B1和SiNRT1.1B2均具有硝酸盐转运功能。此外对转基因水稻中SiNRT1.1B1和SiNRT1.1B2的表达量进行了检测,且成功构建了6个基因编辑载体,将用于后续的谷子遗传转化。综上所述,谷子中的基因SiNRT.1.1B1和SiNRT1.1B2均具有硝酸盐转运功能,为进一步的基因功能研究奠定基础。
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