视网膜色素变性(Retinitis Pigmentosa,RP)是遗传性视觉损害和盲目的最常见原因之一,表现为进行性感光细胞及视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial, RPE)功能丧失。其确切病因不明,一旦发病,无论患者自身修复或临床常规治疗均很难逆转该病进程。与之完全不同的是,我们在低等脊椎动物鱼和两栖类看到,视网膜损伤后可以完全修复和再生,原因是其视网膜中终生存在具有内源性干细胞潜能的Muller胶质细胞。在病理情况下,该Muller胶质细胞能够逆分化为视网膜干细胞,发挥神经再生的作用,完全恢复视网膜功能。但在高等哺乳动物,Muller细胞的干细胞潜能受到很大的限制。寻求一种安全有效的途径,持续激活视网膜Muller细胞,是实现高等哺乳动物视网膜神经再生的瓶颈问题。通过对视网膜变性和再生过程中Muller细胞逆分化情况及其调控机制的研究,可能揭示成年哺乳动物视网膜再生的奥秘。NaIO3引起的急性视网膜变性是一种经典的视网膜色素变性模型。皇家外科学院大鼠(Royal College of Surgeon’s rat,RCS rat)是一种研究遗传性视网膜色素变性的经典模型,其发病机制和转归与人类相似。骨髓间充质干细胞(Bone Marrow mesenchymal Stem Cells,BMSCs)移植治疗视网膜变性疾病的显著疗效在国内外研究中均得到了广泛的证实,可以用于研究视网膜再生。有研究发现,变性损伤视网膜细胞和BMSCs均能不同程度的分泌一种或多种神经营养因子(Neurotrophic factors, NTs)。NTs介导的信号通路对干细胞存活、迁移、粘附、自我更新和分化命运都有重要的影响。它经由p27kip1介导可促进干细胞进入细胞分裂周期[35-37],经由Hes1可促进干细胞向神经方向分化,抑制胶质命运[39-42]。但在视网膜变性和干细胞移植后神经再生过程中,该信号途径发生了怎样的变化,能否发挥其重要的调控功能,并对Muller细胞产生影响,目前尚不清楚。基于上述研究现状和本实验室基础,我们提出如下假说：釚性视网膜色素变性过程中可能通过分泌有限的NGF等NTs,经由Hesl短暂邀Muller细胞的逆分化,随着NTs的消失,最终导致Muller细胞胶质化。而慢性视网膜色素变性过程中,移植的BMSCs能够持续分泌NTs,抑制Muller细胞的胶质命运,进而促进Muller鱼胞逆分化和神经再生,延缓视网膜色素变性疾病进程,挽救视功能。我们将探讨神经营养因子信号通路参与Muller细胞逆分化和胶质化命运调控的可能机理,研究结果为建立有临床应用前景的内源性干细胞神经再生奠定理论基础。本研究包括两个部分：第一部分：大鼠急性视网膜色素变性过程中Muller细胞逆分化和转分化的分子机制研究正常大鼠采用NaIO3腹腔注射,建立急性视网膜色素变性模型。注射PBS的正常大鼠作为对照。通过视网膜冰冻切片免疫荧光双标技术和qRT-PCR技术观察到在损伤后3-7天,视网膜Muller细胞重新回到细胞周期出现逆分化,表达细胞增殖标记BrdU. PCNA,视网膜干细胞表达PAX6,且转分化表达视网膜神经元标记crx、rhodopsin。同时,蛋白芯片、ELISA、免疫荧光双标技术和qRT-PCR检测发现,视网膜中NGF含量增高,Muller细胞NGF/TrkA信号高表达,其下游的细胞周期依赖激酶抑制剂p27kip1表达降低,核蛋白Cyclin D1表达增高,调控细胞重新回到细胞周期开始分裂增殖。此外,NGF/TrkA信号通路下游的转录抑制因子Hes1表达降低,促进Muller细胞的神经分化。该活化过程非常短暂,到了损伤后28天,NGF/TrkA信号通路关闭,Muller细胞逆分化和神经分化水平降低,Muller细胞走向胶质命运出现胶质化,大量表达GFAP。为进一步验证该分子机制在视网膜修复过程中的调控模式,我们选择了更加稳定和成熟的慢性遗传性视网膜变性模型——RCS大鼠,行rBMSCs视网膜下腔移植。第二部分：RCS大鼠移植rBMSCs后Miiller细胞逆分化和转分化的分子机制研究将rBMSCs移植到RCS大鼠视网膜下腔作为实验组,视网膜下腔注射PBS的RCS大鼠作为伪手术组,未处理的RCS大鼠作为空白对照组。通过ERG检查发现术后2w、4w、8w,大鼠视网膜功能显著改善,明显高于PBS伪手术组和空白对照组。同时,外核层厚度亦较对照组增加。视网膜冰冻切片免疫荧光双标技术和qRT-PCR检测观察到在移植后2-4w,视网膜Muller细胞重新回到细胞周期出现逆分化,表达细胞增殖标记BrdU、PCNA,视网膜干细胞表达SOX2、PAX6,且转分化表达视网膜神经元标记crx、opsin。将体外培养的Muller细胞与rBMSCs共培养,通过细胞免疫荧光双标染色发现,Muller细胞同样出现逆分化,表达细胞增殖标记BrdU,视网膜干细胞标记SOX2,转分化表达视网膜感光前体细胞标记crx。通过ELISA检测发现,rBMSCs能够大量释放NGF,其培养基中NGF含量是对照组的3-5倍。同时,我们还发现NGF蛋白可以在离体和在体情况下短时间内激活Muller细胞逆分化,表达细胞增殖标记BrdU,视网膜干细胞标记SOX2等。而NGF中和抗体则可以暂时部分抑制1BMSCs对Muller细胞的作用。经免疫荧光双标技术和’Western-blot技术检测发现,移植组视网膜Muller细胞高表达NGF受体TrkA,且NGF/TrkA信号通路下游分了p-PI3K、p-Akt、p-CREB均表达增加。至术后8w,NGF/TrkA信号通路表达降低,Muller细胞逆分化也回到对照组水平。体外培养的rBMSCs同样可以上调Muller细胞NGF/TrkA信号通路下游分子p-PI3K、p-Akt、 p-CREB蛋白水平的表达。且在该体系中加入TrkA阻断剂252a后,NGF/TrkA信号通路表达降低,Muller细胞逆分化被抑制。与急性视网膜色素变性过程中NGF少量分泌短暂激活Muller细胞相比,视网膜神经再生过程中,移植的rBMSCs能够更加稳定的分泌NGF,持续激活Muller细胞逆分化和神经分化,显著改善视功能。在两个阶段Muller细胞的活化中,NGF/TrkA信号通路均发挥了重要的调控作用。本研究结论：1、大鼠急性视网膜色素变性初期,Muller细胞表现出内源性干细胞潜能,短暂的逆分化并转分化为视网膜神经元,表达视网膜前体干细胞和视网膜神经元标记。同时,变性视网膜在早期短暂性地分泌NGF并激活其受体TrkA。这一结果提示内源性干细胞可以被急性视网膜色素变性短暂激活,为研究内源性干细胞在视网膜变性中的作用奠定了基础。2、率先研究了rBMSCs在在体和离体情况下,持续激活视网膜内源性干细胞Muller细胞,使Muller细胞重新进入细胞周期并促进其逆分化和转分化,发挥神经再生作用,挽救视功能。为干细胞经激活内源性干细胞治疗视网膜变性疾病提供了实验证据。3、体外培养的rBMSCs可以稳定持续地分泌NGF,该分子可以在在体和离体情况下,促进视网膜内源性干细胞Muller细胞重新进入细胞周期并向神经元方向分化。可能是rBMSCs治疗视网膜变性疾病有效性的机制之一。4、本研究发现,NGF/TrkA信号通路是rBMSCs激活Muller细胞逆分化的重要调控途径,它经p27kip1开启Muller细胞逆分化,并经有Hes1促进其向神经分化,抑制胶质命运。揭示了rBMSCs促Muller细胞逆分化的分子机制。