论文部分内容阅读
本研究以前期通过生物信息学手段预测得到的拟南芥渗透胁迫相关基因为基础,采用real-timePCR方法,对预测基因进行筛选。将筛选到的渗透胁迫应答基因转化烟草,验证基因的功能。获得了2个具有抗渗透胁迫功能的新基因。该研究结果为前期的基因功能预测工作提供了实验证明,也为植物抗渗透胁迫基因工程提供了新的基因资源。
取得的主要研究结果如下:
1.Real-timePCR筛选渗透胁迫应答基因通过real-timePCR方法对8个拟南芥基因在渗透胁迫前后的表达水平进行了检测,得到了4个渗透胁迫条件下上调表达的基因,分别命名为AtMYB126,AtIMP,AtDBP1,AtDBP2。
2.植物表达载体的构建通过RT-PCR克隆了上述4个渗透胁迫应答基因,构建了由组成型启动子CaMV35S调控的植物表达载体pBMYB,pBIMP,pBP1,pBP2。将其导入到农杆菌BLA4404,以用于下一步转化烟草。
3.烟草的遗传转化以烟草“龙江911”为受体材料,利用农杆菌介导法将上述4个植物表达载体进行遗传转化,获得抗性植株。
4.转基因植株的筛选及抗逆性检测抗植株扣叶盘,置于含Km的分化培养基上进行二次筛选,得到遗传背景完全一样的转基因烟草。转AtMYB126基因的30个株系二次筛选得剑25个分化株系;转AtIMP基因的31个株系二次筛选得剑25个分化株系:转AtDBP1基因的24个株系二次筛选得剑21个分化株系;转AtDBP2基因的24个株系二次筛选得到20个分化株系。
对二次筛选得到的幼苗进行抗盐性及抗旱性检测。共获得转AtDBP1基因的抗盐植株11个,其中既抗盐又抗旱的植株4个;获得转AtDBP2基因的抗盐株系11个,其中5个株系既抗盐有抗旱;AtMYB126、AtIMP在逆境胁迫下的表现与对照植株并无明显差异。
5.抗逆转基因植株的分子检测对具有抗逆性的植株进行了PCR检测及real-timePCR检测。对转AtDBP1基因的12个耐盐株系进行PCR检测,获得阳性植株10个,从中选取5个抗性较好株系进行real-timePCR检测,结果表明AtDBP1基因在2个株系中超量表达:对转AtDBP2基因的11个耐盐株系进行PCR检测,获得阳性植株9个。选取5个抗性较好的株系进行real-timePCR检测,结果发现AtDBP2基因在4个株系中超量表达。
6.抗性植株的生理指标检测对real-timePCR检测超量表达的株系进行生理指标的检测。相对电导率测定结果表明,real-timePCR检测超量表达的抗性株系胁迫处理后的相对电导率与对照株系相比保持在相对稳定的水品;叶绿索含量的测定结果表明,real-timePCR检测超量表达的抗性株系胁迫处理后的叶绿素含量降低幅度要小于对照株系。