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研究背景众所周知,晚期癌痛患者所遭受的恶性情绪体验,如焦虑、恐惧、孤独、甚至厌世等给病人造成的身心伤害远比疼痛本身更为严重,但近四十年来,由于缺乏适当的动物模型和相应的技术手段,对疼痛情感特性机制和治疗的研究明显滞后。临床上常使用的药物治疗、阻滞治疗等方法,大多针对急性疼痛或其他类型的疼痛感觉的缓解,对慢性疼痛尤其癌性疼痛伴随的不良情绪体验的作用十分有限,因此寻找一种安全有效、作用持久,既能缓解疼痛感觉,又能控制疼痛伴随的不良情绪的镇痛方法,已成为疼痛研究的重要方向。动物及人类的脑成像、电生理学和行为学等证据表明伤害性刺激或预警信号均可激活前扣带皮层(ACC)。损伤ACC特别是它的吻侧部,可以破坏痛相关厌恶情绪的形成。大量研究表明,兴奋性氨基酸尤其是谷氨酸在ACC兴奋性突触传递中具有关键作用。过去的工作研究表明ACC内注射NMDA受体谷氨酸位点拮抗剂APV可以阻断福尔马林条件位置回避(F-CPA)的形成(一种反映痛相关厌恶情绪的行为模型),提示ACC内NMDA受体的激活在痛相关的情绪形成过程中发挥重要的作用。功能性NMDA受体是由一个必需的NR1亚基和一个或多个NR2A-D亚基构成的异聚体,它的功能受多种因素调节,其中NRl为必需功能亚基,NR2属于调节亚基,考虑到NR2亚基在前脑的分布主要以NR2A和NR2B两个亚基为主,结合进一步研究,NR2B亚基在疼痛的产生和中枢痛觉过敏的形成中发挥着主导作用,特异性抑制或阻断NR2B功能的病理性上调可以达到良好的疼痛治疗效果,被认为是很有希望的新型镇痛方法。但目前已有的NR2B受体拮抗剂或阻断剂如CP101606,RO256981等,由于其心脏毒性至今不能用于临床,因此把NMDA受体NR2B亚基作为靶点,寻找新的技术对于疼痛伴随的不良情绪的治疗成为一个新领域。SiRNA技术的高效、特异、稳定、周期短及操作简单等优势是传统的基因阻断技术如基因敲除及DNA陷阱、反义技术、核酶等所无法比拟的,它已经成为敲除特定基因在哺乳动物细胞系中表达的强大而有效的工具。另外慢病毒载体因其对分裂缓慢或分类终末期的细胞的高效转染能力已经作为一种常用的基因转移工具被广泛应用于基因治疗和其他研究领域。本研究拟把NMDA受体NR2B亚基作为靶点,利用慢病毒载体可以高效转染神经元的能力,将可以干扰靶点基因表达的SiRNA转染进ACC神经元,沉默NR2B基因的表达,旨在控制NMDA受体NR2B亚基相关的疼痛伴随的不良情绪。研究方法与结果1、NR2B/RNAi重组慢病毒对ACC神经元NR2B基因表达的沉默效应方法：提取新生大鼠ACC神经元进行原代培养,用免疫荧光法对培养的神经元进行纯度鉴定,用MTT法对神经元进行活性的检测,把纯度和活性合格的神经元用于后续实验。将神经元分为三组：CONTROL组、NC-GFP-LV组和NR2B-RNAi-LV组,将构建好的NR2B-RNAi重组慢病毒转染NR2B-RNAi-LV组,空病毒(具有无义干扰序列的重组慢病毒)载体转染NC-GFP-LV组,等体积的生理盐水转染CONTROL组。三天后在荧光显微镜下观察转染效率,然后提取RNA和蛋白,用RT-PCR和Western Blot法检测NR2B的表达情况。结果：在荧光显微镜下随机拍取的荧光图片显示,重组慢病毒载体对原代培养的ACC神经元有很好的转然效率(达98%),而CON组没有荧光表达。RT-PCR结果显示,NC-GFP-LV组NR2B基因mRNA表达与CON组细胞比较无显著差异,NR2B-RNAi-LV组NR2B基因mRNA表达较阴性对照组和空白组均明显下降。WB结果显示,β-actin内参照的表达均在同一水平的情况下,NR2B-RNAi-LV组细胞NR2B蛋白的表达明显低于NC-GFP-LV组和CON组,而NC-GFP-LV组和CON组NR2B蛋白的表达无明显差异。2、ACC区注射NR2B/RNAi重组慢病毒对福尔马林诱导的痛情绪体验的治疗效应方法：选取正常雄性SD大鼠,随机分为CON组、NC-GFP-LV组和NR2B-RNAi-LV组。在大鼠脑立体定位仪下分别向ACC注射生理盐水、空病毒和NR2B/RNAi重组慢病毒。7d后进行行为学检测(大鼠急性痛行为、福尔马林诱导的条件位置回避和电击诱导的条件位置回避),然后处死动物提取大鼠脑组织ACC组织块,做成冰冻切片在荧光显微镜下观察转染效率,提取mRNA和蛋白,用RT-PCR和Western Blot法检测NR2BmRNA和蛋白的表达情况。结果：行为学检测显示,NR2B/RNAi重组慢病毒注射7天后,大鼠福尔马林急性痛行为在三组之间没有明显差异；F-CPA实验中,CON组和NC-GFP-LV组F-CPA模型成功建立,而NR2B-RNAi-LV组F-CPA模型不能成功建立；在S-CPA实验中,CON组、NC-GFP-LV组和NR2B-RNAi-LV组均可以成功建立S-CPA模型。随机拍取的荧光图片显示,NR2B-RNAi-LV组和NC-GFP-LV组有大量荧光表达,而CON组荧光表达不明显。RT-PCR结果显示,NC-GFP-LV组NR2B基因mRNA表达与CON组细胞比较无显著差异,NR2B-RNAi-LV组NR2B基因mRNA表达较而CON组和NC-GFP-LV组均明显下降。WB结果显示,β-actin内参照的表达均在同一水平,NR2B-RNAi-LV组细胞NR2B蛋白的表达明显低于NC-GFP-LV组和CON组,而NC-GFP-LV组和CON组NR2B蛋白的表达无明显差异。3统计学处理数据采用SPSS17.0统计软件包进行分析,实验结果的数据皆以X士S表示,福尔马林或电击处理前后大鼠在条件训练室的时间之间的比较采用配对t检验,不同处理组之间F-CPA或S-CPA得分的比较采用单因素方差分析;实时荧光定量PCR组内和组间比较,采用均数T检验。所有分析均取p<0.05作为差别有显著性的标准。研究总结本研究构建的NR2B/RNAi慢病毒载体体外感染ACC神经元,可有效沉默NR2B的表达；福尔马林炎性痛模型表明,rACC给予NR2B/RNAi慢病毒可有效抑制痛厌恶情绪反应,同时不影响认知功能。