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目的：
1、构建激素依赖性前列腺癌和激素非依赖性前列腺癌的miRNAs表达谱。
2、找出与前列腺癌雄激素非依赖性转变过程相关的miRNAs。
方法：
1、本实验以雄激素依赖性前列腺癌LNCaP细胞为实验的对照组,长期培养在加有氟他胺的无雄激素环境中培养的雄激素非依赖性LNCaP细胞即AI-LNCaP为实验组,两组细胞于37℃,5％CO2培养箱中培养,平均三天换培养液一次,六天传代一次。
2、实验组和对照组细胞平行传代后的第四天,(此时两组细胞处于对数生长期,培养瓶底达80％覆盖率),收集细胞。
3、采用Ambion公司提供的mirVanaTM PARIS Kit提取实验组和对照组细胞总RNA,此过程严格按照试剂盒说明书进行。
4、取实验组和对照组总RNA各1μl,用DEPC水稀释后70°变性2分钟,上Agilent2100对样品的纯度和浓度进行检测。
5、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离小片段RNA,割胶分离,对小分子RNA进行绝对定量后用solexa高通量测序仪对实验组和对照组的小片段RNA(<40nt)进行测序。
6、solexa测序所得出的数据与人基因组序列进行比对分析。
7、将测序所得出的sRNA序列信息和miRNA文库比对分析,筛选出两组细胞表达的miRNAs。
8、对solexa测序得出的miRNAs原始数据进行分析,筛选出实验组和对照组之间差异表达的miRNAs。
9、实时荧光定量PCR对筛选出差异表达的miRNAs进行验证。
结果：
1、平行传代后第五天将实验组和对照组细胞于倒置显微镜观察,发现细胞贴壁生长良好,折光性好,细胞瓶底覆盖率达70-80％,处于对数生长期,可以用于试验。
2、Agilent2100对所提取总RNA进行检测结果显示:实验组细胞总RNA的RIN值为9.8,28s:18s=2.1,对照组细胞RIN值为9.4,28s:18s=1.9,所提取实验组和对照组细胞的总RNA未发生降解,其完整性、纯度及总量均符合solexa样品制备要求。
3、Solexa测序的结果显示实验组细胞内长度为22nt的小分子RNA占所有测序结果的41.88％,测序无杂峰干扰的小分子RNA序列占68.83％；对照组细胞内长度为22nt的小分子RNA占所有测序结果的42.10％,测序无杂峰干扰的小分子RNA序列占74.57％。
4、Solexa测序所得的原始数据与人基因组序列进行比对分析,结果显示测序结果与基因组序列有良好的符合率。实验组测序的结果分析显示全长sRNA序列与基因组序列的符合是74.25％,每条sRNA序列的表达量与基因组序列的符合率是93.63％；对照组细胞测序结果分析显示全长sRNA序列与基因组序列的符合是62％,每条sRNA序列的表达量与基因组序列的符合率是94.18％。两组细胞间公共序列分析结果显示:两组间共同表达的小分子RNA占所测出的小分子RNA的88.90％,；实验组细胞表达而对照组细胞不表达的小分子RNA占所测出的小分子RNA7.50％；对照组细胞表达而实验组细胞不表达的小分子RNA占所测出的小分子RNA3.60％。
5、sRNA与miRBase的比对结果显示:实验组细胞检测出miRNA共376个,对照组细胞检测出miRNA共357个。
6、以差异倍数≥2.0和p≤0.001为标准筛选出实验组细胞和对照组细胞之间差异表达的miRNAs共94个,其中48个表达上调,46个表达下调。
7、采用Mireap软件共预测出15个新的miRNAs,其中实验组AI-LNCaP细胞中9个,对照组LNCaP细胞中6个。荧光定量PCR得到验证的有9个miRaNAs。
8、荧光定量:PCR验证在实验组和对照组之间差异表达的miRNAs,结果具有较好的相关性。
结论：
1、成功筛选出实验组细胞和对照组细胞之间差异表达的miRNAs,筛选出的在雄激素非依赖性前列腺癌LNCaP细胞中上调或下调的miRNAs很可能在前列腺癌细胞的雄激素信号传导通路中起重要的调节作用,这为今后进一步深入研究雄激素的信号传导通路奠定了基础。
2、荧光定量PCR得到验证的新预测的9个miRNAs为miRBase数据库增加了新的成员,新miRNAs为进一步研究前列腺癌和前列腺癌的雄激素非依赖性转变的发病机制奠定了基础。