论文部分内容阅读
母-胎界面正常妊娠滋养细胞具有类似肿瘤细胞的高增殖和侵袭能力。胚胎着床时，胚胎的滋养层细胞与子宫内膜细胞相互接触，启动粘附、迁移、基质降解侵蚀母体血管及新生血管生成、侵袭子宫内膜等信号级联反应，完成与肿瘤细胞类似的粘附、侵袭和迁移三个生理过程。但在胎盘形成后，滋养层细胞的侵袭行为又出现与肿瘤细胞侵袭完全不同的节制性。滋养层细胞的侵袭过程是受到人体严格而精细调控的，一旦调节失控则会导致病变。例如滋养层细胞过度侵入与多种妊娠滋养细胞疾病(如葡萄胎、绒毛膜上皮癌等)形成有关，而侵入不足则会造成反复着床失败、自然流产、宫内发育迟缓、先兆子痫或妊高征等。因此，阐明滋养层细胞的侵袭机制将为防治滋养层细胞侵入异常相关的疾病提供理论基础。 泛素特异性水解酶22(ubiquitin specific peptidase22，USP22)是新近发现的一种肿瘤细胞标记基因，其编码产物在多种肿瘤组织高表达并参与调控与细胞转化和细胞周期相关基因的转录。目前关于USP22参与滋养细胞侵袭的研究尚未见报道。为探究USP22在母-胎界面表达及其作用机制，本研究用免疫组化、实时荧光定量PCR及Western-blot技术检测USP22在人早孕期正常妊娠妇女和不明原因复发性流产患者绒毛及蜕膜组织中的表达，继而利用RNAi技术阻断USP22基因在人绒毛膜癌JEG-3细胞中的表达，观察JEG-3细胞侵袭行为的变化，并测定基质金属蛋白酶MMP-2和9的表达，试图从分子和细胞水平探讨该基因在母-胎界面的表达及其对滋养细胞侵袭调控的影响，为进一步加深对生理状态(胚胎植入)和病理性疾病(自然流产、滋养细胞疾病等)的理解提供新的线索。 第一部分 USP22基因在人早孕期母-胎界面的表达调控 目的：探讨USP22基因在人早孕期正常妊娠及复发性流产患者母-胎界面的表达及定位。 方法：分别采用免疫组织化学方法、荧光实时定量PCR法、Western blot检测20例早孕期正常妊娠妇女及15例不明原因复发性流产患者绒毛、蜕膜组织中USP22的定位、rnR.NA及蛋白表达水平。 结果：(1)免疫组化显示在早孕期正常妊娠及复发性流产患者绒毛及蜕膜组织中均表达USP22，且在绒毛细胞滋养细胞中高表达;早孕期随孕周的增加，绒毛滋养细胞USP22的表达逐渐增强(P＜0.05);与正常妊娠组比较，复发性流产患者绒毛及蜕膜组织USP22的表达量显著下降(P＜0.05)。(2)实时定量PCR显示绒毛及蜕膜组织中均可见USP22mRNA表达;与正常妊娠组比较，复发性流产组绒毛USP22mRNA表达水平显著降低(P＜0.05)，蜕膜组织中USP22mRNA表达水平差异无统计学意义(P＞0.05)。(3)Western blot检测亦显示绒毛及蜕膜组织中均表达USP22蛋白;与正常妊娠组比较，复发性流产组绒毛USP22蛋白表达水平显著降低(P＜0.05)，蜕膜组织中USP22蛋白表达水平差异无统计学意义(P＞0.05)。 结论：USP22在人早孕期母-胎界面表达，并参与了正常早孕期绒毛滋养细胞侵袭的调控和正常妊娠的维持;母-胎界面USP22表达下降可能是导致自然流产发生的原因之一。 第二部分 干扰USP22的慢病毒的制备和感染 目的：针对USP22蛋白编码序列设计能转录生成shRNA的寡核苷酸片段，构建慢病毒介导的siRNA表达载体，包装病毒并感染靶细胞，建立USP22基因稳定下调的JEG-3细胞株。 方法：依据USP22序列采用设计分析软件制备针对USP22基因的siRNA寡核苷酸序列，将其克隆至慢病毒载体PGCL-GFP上构建重组质粒PGCL-USP22，脂质体转染包装细胞293T。24h后，收集上清液，经浓缩，感染JEG-3细胞。采用荧光定量PCR和Western Blot检测JEG-3细胞中USP22的沉默效率。 结果：对重组质粒PGCL-USP22测序结果证实shRNA表达模板成功克隆于PGCL载体上，插入序列完全正确无碱基突变和缺失。利用实时定量PCR和Western blot检测慢病毒感染的JEG-3细胞中USP22的沉默效率，发现:3个PGCL-RNAi细胞克隆出现不同程度的USP22表达下调，其中USP22 shRNA-C表达下调均超过70％，确定为USP22有效沉默。 结论：成功构建慢病毒介导的siRNA表达载体，包装病毒并感染靶细胞，建立了USP22基因稳定下调的JEG-3细胞株。 第三部分 下调USP22对绒癌细胞株侵袭行为的影响 目的：进一步探讨siRNA稳定下调USP22的表达后对绒癌滋养细胞生物学行为及相关分子表达的影响。 方法：比较siRNA稳定下调USP22后绒毛膜癌JEG-3细胞侵袭能力的变化，荧光实时定量PCR及Western blot法检测干扰USP22后滋养细胞MMP-2及MMP-9mRNA及蛋白表达量的变化。 结果：Transwell实验显示:下调USP22表达后JEG-3细胞的细胞穿透数目(12.145±3.125)与对照组(20.143±3.128)相比明显减少，差异有统计学意义(P＜0.01)。 实时定量PCR显示干扰USP22表达后绒毛膜癌细胞MMP-2及MMP-9 mRNA较未干扰组明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01);Western blot法测定干扰USP22表达后绒毛膜癌细胞MMP-2及MMP-9的蛋白表达量较未干扰组明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。 结论:抑制USP22的表达显著降低JEG-3细胞的侵袭能力。USP22促进JEG-3细胞的侵袭可能通过对MMP-2、MMP-9的转录激活来实现的。