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炎细胞浸润是细菌感染性疾病的重要特征,发挥清除病原和防御保护的重要作用。炎细胞的趋化是浸润的前提,该过程由G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)介导。甲酰肽受体(formyl peptide receptor,FPR)是 GPCRs 的一种,其成员包括FPR1、FPR2和FPR3。FPR2(小鼠为Fpr2)因为除了在炎性细胞表达,还在多种组织细胞表达,参与机体多种生物学功能而被广泛关注。人类胎盘表达FPR2的发现,为FPR2在产科领域的研究提供了可能。绒毛膜羊膜炎(Chorioamnionitis,CAM)是最常见的宫内感染性疾病,是引发早产、死胎、新生儿感染和败血症的主要病因,也与胎儿生长发育、新生儿疾病的发生、发展密切相关,是目前产科和儿科专家共同关注的焦点。生殖道逆行感染是CAM重要的感染途径。一般情况下,存在于孕妇生殖道的微生物并不会造成羊膜内感染,但当母体免疫力低下、清除病原体的能力减弱,病原体容易上行引起羊膜及羊膜腔感染。大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)是引起CAM的主要致病菌,FPR2在E.coli引发的感染性疾病作用机制的阐明,将为临床妊娠感染性疾病预防和治疗提供依据。近些年关于FPR2与其配体结合发挥抑制炎症作用的研究备受关注。消退素(Resolvin)是由不饱和脂肪酸衍生出的具有抗炎作用的脂类介质。消退素D1(Resolvin D1,RvD1)是FPR2的配体,明确FPR2/RvD1在炎症相关的妊娠期并发症中的作用可能为产科感染性疾病的预防和治疗提供新的思路。本课题通过应用Fpr2基因敲除小鼠来源的中性粒细胞、转染了 Fpr2基因的人胚胎肾 293 细胞(human embryonic kidney 293 cells,HEK293 cells)和 Fpr2 基因敲除孕鼠感染模型,阐明Fpr2在中性粒细胞趋化和杀死E.coli的作用和机制,明确Fpr2在妊娠感染时对机体的保护作用;收集临床组织标本,研究CAM孕妇胎盘组织样本中FPR2表达和外周血中RvD1浓度的变化,提出FPR2参与CAM病理过程,CAM患者可能存在RvD1相对不足;通过建立体外滋养细胞炎症模型,证实RvD1通过与滋养细胞FPR2结合挽救LPS对滋养细胞功能损害的作用;通过观察预防性应用RvD1对孕鼠感染性早产模型的影响,进一步明确RvD1/FPR2在妊娠感染性疾病的治疗作用。第一部分 Fpr2在E.coli感染早期对机体的保护作用材料和方法1、分离小鼠骨髓中性粒细胞和肠粘膜E.coli并鉴定;2、通过趋化实验观察E.coli上清对野生型(wild type,WT)和Fpr2基因敲除(Fpr2-/-)小鼠骨髓来源的中性粒细胞和转染了 Fpr2的HEK293细胞的趋化作用;3、应用Weston Blotting的方法观察E.coli上清作用后HEK293细胞和转染了Fpr2的HEK293细胞炎症信号通路蛋白的表达差异;4、将WT和Fpr2-/-小鼠来源的骨髓中性粒细胞与E.coli共培养,裂解细胞并涂板,通过计数琼脂板菌落集落研究Fpr2对中性粒细胞吞噬E.coli和杀灭作用的影响;5、通过Elisa法检测过氧化氢释放,明确Fpr2影响中性粒细胞吞噬和杀灭细菌的机制;6、分离WT和Fpr2-/-小鼠骨髓中性粒细胞,用相同浓度Ecoli刺激1h,观察中性粒细胞NETs形成的差异;7、通过腹腔注射灭活的E.coli建立小鼠(WT和Fpr2-/-)腹膜炎模型,应用流式细胞仪计数不同时间点腹腔中性粒细胞数量,同时检测腹腔液趋化因子CXCL1 和 CXCL2 表达;8、通过尾静脉注射E.coli建立小鼠(WT和Fpr2-/-)菌血症模型,4h后收集肝脏做组织切片,观察WT和Fpr2-/-小鼠中性粒细胞在肝脏组织的聚集;9、通过腹腔注射LPS的方法建立孕鼠感染模型,观察WT和Fpr2-/-孕鼠早产时间,子鼠数量、重量,胎盘重量和充血情况,同时收集孕鼠外周血血浆,用Elisa法检测血浆IL-1β、IL-6、IL-10和TNFα含量。结果1、E.coli培养上清能够趋化WT小鼠骨髓中性粒细胞和转染了 Fpr2的HEK293细胞,但对Fpr2-/-小鼠中性粒细胞趋化能力显著降低;2、E.coli培养上清能够诱导转染了 Fpr2的HEK293细胞MAP激酶磷酸化;3、WT小鼠骨髓来源的中性粒细胞能吞噬和杀死E.coli,而Fpr2-/-小鼠骨髓来源的中性粒细胞对E.coli的吞噬和杀灭能力均降低,同时伴有过氧化氢释放的减少;4、Fpr2-/-小鼠中性粒细胞体外形成NETs的能力下降;5、小鼠腹膜炎模型证实,趋化因子CXCL1和CXCL2升高落后于早期中性粒细胞的募集,且Fpr2缺失导致小鼠腹腔中性粒细胞的招募减少;6、小鼠菌血症模型证实,Fpr2敲除降低了中性粒细胞在小鼠肝脏的聚集;7、同等剂量的LPS引发Fpr2-/-孕鼠子宫发生更严重的炎症反应,早产时间提前,胎鼠和胎盘重量比下降,胎盘梗死更加明显。第二部分FPR2在绒毛膜羊膜炎孕妇胎盘组织中的变化材料和方法1、收集孕≥28周,<37周,胎膜早破,在本院经剖宫产分娩,胎盘病理确诊为CAM的患者和相对应孕周,胎膜早破,胎盘病理诊断排除CAM,无妊娠高血压、糖尿病等妊娠并发症妇女的外周血和胎盘组织,用Elisa法检测血浆IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα、RvD1 含量;2、通过HE染色观察CAM患者中性粒细胞的聚集;3、通过免疫组织化学染色观察FPR2、PPARy的表达和组织定位;4、应用Weston Blotting检测CAM患者和正常产妇胎盘组织FPR2、PPARy表达的差异,NF-κB信号通路中NF-κBp65、IκB表达差异以及RvD1合成酶5脂加氧酶(5-lipoxygenase,5-LOX)和15脂加氧酶(15-lipoxygenase,15-LOX)的变化。结果1、CAM患者血清IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα浓度升高,RvD1浓度降低;2、CAM患者胎盘组织大量中性粒细胞浸润;3、CAM患者胎盘组织FPR2和PPARy表达升高,PPARy胞核表达未见明显改变;RvD1合成酶15-LOX和5-LOX未见明显改变;NF-κBp65在组织细胞胞核表达增多,胎盘组织总蛋白IκB表达下降。第三部分RvD1/FPR2对LPS作用后人滋养细胞生物学功能改变的影响材料和方法用终浓度为10ug/mL的LPS刺激体外培养的HTR8-Svneo人滋养细胞作为炎症模型。实验分为5组:①对照组,②LPS作用组,③LPS+RvD1作用组,④WRW4(FPR2 拮抗剂)+LPS+RvD1 作用组,⑤GW9662(PPARγ 拮抗剂)+LPS+RvD1 作用组。1、ELISA法检测细胞上清IL-1β、IL-6、TNFα、IL-10等炎性因子的分泌;2、通过细胞划痕实验、成管实验、CCK8实验以及流式细胞分析等方法对各组细胞的迁移能力、管生成能力以及增殖和凋亡进行检测;3、应用Weston Blotting检测各组细胞FPR2和IκB的表达变化,观察PPARγ和NF-κBp65核转位的变化;4、通过LPS腹腔注射的方法建立孕鼠感染模型,观察提前应用RvD1对孕鼠子宫炎症反应程度、早产比例和子鼠死产率的影响。结果1、HTR8-Svneo 人滋养细胞表达 TLR4、FPR2 和 PPARγ;2、RvD1/FPR2能够减少细胞上清中IL-1β、IL-6、TNFα等炎症因子的分泌,改善了 LPS引发的滋养细胞功能损害,降低了细胞凋亡;3、RvD1/FPR2改善滋养细胞功能的作用与NF-κB信号通路的抑制相关,PPARγ可能参与了该过程;4、RvD1预处理降低了 LPS诱发的孕鼠感染模型的炎症反应,提高了子鼠的活产率。全文结论1、FPR2在机体感染E.coli早期发挥重要的保护作用;2、CAM患者RvD1合成不足,可能加速炎症发展;3、RvD1通过与滋养细胞表面的FPR2受体结合能够挽救LPS造成的滋养细胞功能损伤;4、RvD1/FPR2抑制炎症的作用可能通过激活PPARγ,阻断NF-κB信号通路而实现;5、预防性应用RvD1,能够改善剧烈炎症反应引发的孕鼠早产和死胎发生结局。