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水稻白叶枯病是我国仅次于稻瘟病的重要水稻病害。中国水稻抗白叶枯病的主要问题是能够利用的抗性基因源单一,现已采用常规结合分子标记辅助选择及转基因技术培育抗病基因聚合系。因此,挖掘和利用白叶枯病抗性基因资源对栽培稻进行品种改良具有重要意义。
疣粒野生稻具有一系列栽培稻不具有的优良遗传性状,是我国现存的三种野生稻之一,对白叶枯病有极高的抗性。但是由于它的染色体组与栽培稻的差异很大,有性杂交不亲和,难以把疣粒野生稻中的优良基因转移到栽培稻中。所以,本文对利用不对称细胞融合技术转移疣粒野生稻对百叶枯病抗性到栽培稻中进行了探索研究。主要研究结果如下:
1.建立了良好的疣粒野生稻胚性悬浮细胞系,得到了疣粒野生稻的最佳悬浮培基:AA大量元素+B5微量元素+B5有机成分+300mg·L-1CH+500mg·L-1Pro+500mg·L-1Gln+2mg·L-12、4-D+3.0%蔗糖。
2.以疣粒野生稻悬浮细胞为材料,建立了疣粒野生稻原生质体培养植株再生体系。系统地研究了影响原生质体分离、纯化、培养和植株再生的各种因素,得到了疣粒野生稻的最佳酶解体系:27.5℃黑暗条件下,1.5%纤维素酶+0.2%果胶酶+5mmol·L-1MES酶解4h。原生质体用优化的培养基KM8p+2mg·L-12、4-D+0.2mg·L-16-BA+500mg·L-1CH+100mg·L-1Pro+10%葡萄糖。
3.利用PEG结合高pH-高钙诱导法获得了疣粒野生稻与日本晴对称性融合的杂种细胞。最佳融合条件为:40%PEG(8000)+50mmol·L-1CaCl2·2H20,pH=10.5,融合30miN,融合率为1.5%。
4.用UV对疣粒野生稻原生质体进行失活处理,发现影响不是很明显,大多数细胞仍能分裂;用2.5mmol·L-1IOA处理日本晴原生质体15min失活效果最好。
5.用白叶枯病菌Y8侵染云南三种野生稻成株和离体叶片后,记录病斑,疣粒野生稻是高抗,普通野生稻为中感,药用野生稻是中抗,测定它们的MDA、SOD、POD、CAT等后发现酶活与抗性成正相关,MDA含量与抗病性成负相关。
建立的疣粒野生稻原生质体植株再生体系及疣粒野生稻与日本晴对称性融合的稳定杂种细胞的获得,为后续利用体细胞杂交技术转移疣粒野生稻优良性状和基因到栽培稻的研究打下了很好的基础。